(5 оценок, среднее: 4,80 из 5)
Загрузка...
Учебная работа. Радиоактивные изотопы и соединения
Хотя представленный материал рассчитан на малоподготовленного читателя, надеюсь, что он может оказаться полезным и для экспертов.
1. Главные понятия и терминология
Радиоактивность (radioactivity) — это обозначение необычного явления природы, открытого Беккерелем в конце XIX века, сущность которого заключается в самопроизвольном спонтанном превращении атомных ядер неких частей в остальные, которое сопровождается выделением трёх видов «лучей». Природу лучей установили стремительно: б-лучи — это дважды ионизированные атомы гелия, в-лучи — это электроны, г-лучи — это твердое коротковолновое электромагнитное излучение. Элементы, способные к таковым превращениям стали называться радиоактивными, т.е. способными к этому превращению. Зависимо от типа излучения, радиоактивные атомы стали определять соответственно как б, в либо г излучатели либо источники. правда, скоро было установлено, что некие радиоактивные атомы источают сходу два (а может быть, и три) вида лучей, потому таковая систематизация дополняется пояснениями — это «незапятнанный» б-излучатель либо имеется сопутствующее г-излучение. К начальным трём типам ядерных перевоплощений (б, в и г — радиоактивный распад) добавились новейшие, но, общие закономерности для всех остались постоянными. В конце ХХ века было рекомендовано термин «изотоп» поменять на «нуклид» и, соответственно, «радиоактивный изотоп» на «радионуклид». В особенности широкого распространения это нововведение не получило, и оба термина употребляются в научной литературе как синонимы.
Численная черта радиоактивности получила у физиков заглавие «активность» (activity). Потому что физикам никто не давал монопольного права на термин «активность», то с течением времени выяснилось, что в различных областях науки под «активностью» соображают совершенно различные понятия. Сравните: активность радиоактивного изотопа, хим активность элемента либо соединения, энзимологическая активность фермента, био (к примеру, антивирусная) активность продукта — всё это совсем разные понятия. Сближение разных научных дисциплин ещё больше запутывает положение. Попытайтесь охарактеризовать фермент, меченный радиоактивным изотопом углерода-14. Активность такового фермента — это его энзимологическая черта либо радиоактивная? Потому в современной научной литературе (в особенности био) все почаще термин «активность» для радиоактивных веществ заменяется термином «радиоактивность».
За единицу активности (радиоактивности) радиоактивного вещества в Интернациональной системе СИ принята скорость радиоактивного распада, равная 1 распаду в секунду, которая получила заглавие беккерель — Бк (в британской версии Bq). Устаревшая, но как и раньше применяемая единица активности кюри — Ки (в британской версии Ci) — это активность продукта, эквивалентная активности 1 г железного радия-226 и равная 3,7х1010 распадов в секунду, т.е. 3,7х1010 Бк.
Строго говоря, радиоактивный распад — это перевоплощение ядра атома радиоактивного элемента, которое сопровождается выделением товаров такового перевоплощения. к примеру, электрический захват представляет собой поглощение электрона ядром с выделением г-кванта, и таковой тип «радиоактивного распада» наиболее буквально следует именовать «ядерным перевоплощением». Вообщем, оба термина употребляются в литературе на равных, невзирая на предпочтительность «ядерного перевоплощения».
Главный законрадиоактивного распада описывается восхитительной формулой:
Nt = N0e-лt
где:
Nt — количество распавшихся радиоактивных атомов;
N0 — изначальное количество радиоактивных атомов;
е — основание натурального логарифма;
л — константа скорости радиоактивного распада;
t — время.
На практике для работы ею никто не пользуется, но, из данной формулы следует сходу несколько достаточно обычных, но весьма принципиальных выводов и следствий, которые нужно знать всем работающим с радиоактивными изотопами:
1. количество радиоактивных атомов, распавшихся за некое время наблюдения, зависит лишь от их начального количества и времени наблюдения (распада). Никакие остальные характеристики: астрономические, физические, хим, парапсихологические и «чудесные» на радиоактивный распад не влияют. Константа скорости радиоактивного распада [ л ] (время от времени ее именуют константой распада) определяется лишь природой изотопа и для всякого изотопа имеет свою величину. Все пробы замедлить радиоактивный распад остыванием (даже в водянистом азоте) либо убыстрить распад нагреванием полностью глупы. Вы сможете влиять на стабильность хим соединения, меняя температуру его хранения, но количество радиоактивных атомов в препарате при всем этом не поменяется.
2. Скорость радиоактивного распада изменяется по экспоненте (т.е. нелинейно), и рассчитывать количество радиоактивного материала в вашем препарате нужно с учетом этого факта, пользуясь или вышеприведенной формулой, или надлежащими таблицами распада (что обычно и делают на практике).
3. Представьте для себя, что в формуле радиоактивного распада Nt = 1/2 N0 , т.е. распалась ровно половина радиоактивных атомов, содержащихся в препарате. время этого процесса — константа Т12 — именуется периодом полураспада. Физический смысл — время, за которое распадается половина радиоактивных атомов данного изотопа. Эта величина очень полезна для работающих с радиоактивностью, т.к. дозволяет стремительно оценить «утраты на распад» продукта.
4. Физический смысл константы скорости радиоактивного распада [ л ] — это активность 1 моля (либо ммоля) 100% радиоактивного изотопа и соответственно размерность данной константы — Бк/моль (Bq/mol) либо Ки/ммоль (Ci/mmol). Другими словами, это на теоретическом уровне достижимая молярная активность (активность 1-го моля радиоактивного вещества), познание которой дозволяет оценить чувствительность способа и свойство радиоактивного продукта. Ниже о этом будет сказано подробнее.
2. Детекция и количественные измерения радионуклидов
Детектирование радиоактивного распада основано на его разных физических свойствах:
· способность вести взаимодействие с кристаллами бромистого серебра, засвечивая светочувствительные материалы, — авторадиография,
· способность вызывать «свечение» при столкновении товаров распада с некими субстанциями — сцинтилляция,
· способность ионизировать молекулы окружающей среды продуктами радиоактивного распада — ионизация,
· способность вызывать недостатки в кристаллических сетках,
· способность производить (либо катализировать) некие хим реакции.
Все эти возможности были задействованы при разработке разных измерительных устройств и индикаторов различного предназначения. Но, для измерения активности, т.е. количества ядерных перевоплощений в единицу времени, более обширное распространение получили приборы, основанные на использовании сцинтилляции либо ионизации. При всем этом в life science употребляют, как правило, сцинтилляционные приборы и авторадиографию, а для физических, инженерных и мед работ — приборы, измеряющие ионизацию среды. Вообщем, такое разделение очень условно, потому что различных устройств и средств измерений было сотворено за 100 лет весьма много.
Следует особо выделить приборы для измерения ионизирующей возможности излучения. Это важная составляющая контроля за облучением персонала, работающего с источниками ионизирующего излучения (в том числе и с радиоактивными субстанциями). Контроль за радиационной обстановкой осуществляется по особенным правилам, и короткая информация о нормах радиационной угрозы и единицах, в каких эти нормы установлены. Пока следует выделить, что активность радиоактивного продукта и радиационная обстановка около этого продукта — это совсем различные свойства, к примеру, как масса вещества и его твердость. Единицы активности (Бк либо Ки) молвят о количестве ядерных перевоплощений в единицу времени. Более пользующаяся популярностью единица экспозиционной дозы для г- (рентгеновского) излучения — рентген (Р) — гласит о величине потока ионизирующего излучения (потока энергии), проходящего через слой сухого воздуха и вызывающего ионизацию определенного числа молекул воздуха. Потому никакой прямой связи меж этими величинами нет. Большая часть радионуклидов, которые употребляются в life science (о этом ниже), совершенно никак не быть может охарактеризована термином экспозиционная доза, который введен для г- (рентгеновского) излучения.
2.1. Авторадиография
Это исторически самый 1-ый и, как и раньше, очень пользующийся популярностью способ детекции разных радионуклидов. Основное преимущество авторадиографии — простота и доступность. Выдержите (проэкспонируйте) эталон с рентгеновской пленкой, потом проявите пленку в обычных критериях — и получите картину распределения радионуклида по поверхности эталона: геля, тонкослойной хроматограммы и т.д.
Если приобретенная «картина» вас не устраивает — можно повторить экспозицию с новейшей пленкой, увеличивая (либо понижая) время по собственному желанию. Обычно время экспозиции меняют в 2ч3 раза, потому что изменение времени экспозиции на 20ч30% существенных конфигураций в картину не заносит.
Весь сиквенс ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) и РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов) с радиоактивным фосфором употреблял только авторадиографию. Флюоресцентная метка фактически на сто процентов вытеснила радиоактивные изотопы из секвенирования, но авторадиография остается обширно используемым способом детекции.
Основной недочет авторадиографии — трудности с количественной оценкой. При зрительном определении даже интуитивно ясно, что интенсивность «почернения» пленки пропорциональна количеству радиоактивных атомов в этом месте. Но вопросец о данной «пропорциональности» нуждается в пояснении. Существует несколько типов сканеров, позволяющих достаточно буквально определять интенсивность «зачернения» пленки и, как следует, ассоциировать пятна инструментально, а не «на глаз«. Оказалось, что спектр активности продукта, в каком интенсивность «зачернения» пленки прямо пропорциональна количеству радиоактивных атомов, весьма невелик и зависит от времени экспозиции эталона с пленкой, типа пленки, природы радионуклида (тип распада и энергия излучения) и даже от режима обработки пленки. к примеру, для фосфора-32 за ночь (то есть темное время суток) экспозиции линейная зависимость «зачернения» пленки от активности эталона находится в спектре 0,5ч25 Бк на мм2 (приблизительно 30ч1500 имп/мин). Предстоящее повышение активности эталона, к примеру, до 100 Бк на мм2 не приводит к большей интенсивности «зачернения» — всё уже «зашкалило».
Потому, обычный совет для начинающих работать с количественной авторадиографией. Сделайте несколько калибровок — нанесите ряд пятен поперечником 1ч1,5 мм с активностью 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проэкспонируйте их с рентгеновской пленкой различное время и опосля обработки пленки просканируйте её на собственном приборе. Вы сходу обусловьте спектр, в каком ваши следующие количественные измерения радиоавтографов будут корректными. Для различных радионуклидов таковой спектр различается весьма значительно, но учесть его нужно в любом случае.
Для роста чувствительности авторадиографии (поточнее, для уменьшения времени экспозиции) можно пользоваться усиливающими экранами. Это очень отлично для фосфора-32 либо йода-125, но фактически никчемно для мягеньких (слабоэнергетических) в-излучателей. Внедрение экрана для фосфора-32 дозволяет понизить время экспозиции в 2ч3 раза, но за это приходится «платить» ухудшением разрешения, которое происходит за счет «размывания зон».
2.2. Сцинтилляционные счетчики
Эффект сцинтилляции для количественного определения радионуклидов начинали применять еще во времена Резерфорда, который зрительно считал сцинтилляционные вспышки под микроскопом. За 100 лет принципных конфигураций не вышло. Рядом с источником излучения помещают сцинтиллятор и ФЭУ (фотоэлектронный умножитель), который считает вспышки. Сцинтиллятор быть может жестким, а быть может и водянистым (почаще, растворенным в воды). Во флакон (vial) с водянистым сцинтиллятором добавляют тестируемый эталон, и в этом случае можно отлично определять даже самое «слабенькое», низкоэнергетическое излучение.
При измерении активности (радиоактивности) всех образцов и для всех средств измерения нужно держать в голове несколько обычных, но принципиальных правил:
10. Радиоактивный распад является традиционным примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение активности как регистрацию случайных событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:
n1/2/n x 100%
где n — число «событий» (в нашем случае распадов)
К примеру, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 4001/2 / 400 х 100% = 5%, т.е. ошибка 5%. Это значит, что чем больше число измерений (фактически счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Наиболее того, вопреки устоявшейся традиции, для понижения математической ошибки измерения нужно считать не число зарегистрированных устройством распадов (импульсов) за единицу времени, а время, нужное для «скопления подходящего» числа импульсов — к примеру, 10000 имп. Тем не наименее, во всем мире активность при помощи счетчиков определяют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минутке).
11. Все счетчики имеют верхний предел измерения, опосля которого их точность падает, потому что счетчик не успевает регистрировать — «захлебывается». Для сцинтилляционных счетчиков — это активность на уровне 106ч107 расп./мин. Некие типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отрешаются считать эталоны, активность которых превосходит установленную для данной модели. Лучшая активность эталона для четкого измерения 104ч106 расп./мин.
12. Проводя количественные измерения, к примеру, определяя концентрацию радионуклида в растворе, постоянно делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независящих аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 — 3 измерений. Издержки времени на «излишние» процедуры будут с лихвой возмещены отсечением случайных «выбросов». Разброс в измерениях, в особенности у начинающих исследователей, может достигать 200% и наиболее, хотя в норме не должен превосходить обыденную ошибку рутинного отбора аликвот.
13. Ни один измерительный устройство не регистрирует 100% всех «распадов» (decompositions) в измеряемом образчике. Эффективность счета — это коэффициент, который связывает зарегистрированные устройством импульсы (counts) и настоящие распады (decompositions). Потому для хоть какого измерения распады/мин. (dpm — decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm — counts per min.). правда, для большинства радионуклидов, используемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет наиболее 90%. Но, тритий удается определять с эффективность не наиболее 50ч60%. Обычно эффективность счета для всякого радионуклида указывается в технической документации к устройству, и длительное время негласное соревнование меж фирмами за наиболее высшую эффективность счета трития было чуток ли не основным движком технического прогресса в данной области.
14. Все измерительные приборы имеют свой «фон» — регистрируют некое количество импульсов без источника ионизирующего излучения (радиоактивного продукта). Природа фона различна: галлактическое излучение, электрический шум, содержание природных радионуклидов в помещении, где установлена измерительная аппаратура и т.д. Потому мало достоверная величина активности, измеряемая устройством, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного устройства. Если в вашем «эпохальном» опыте активность «головного» эталона едва-едва превосходит фон, попробуйте прирастить время измерения (можно до 20 мин.) — тогда достоверность измерения возрастёт.
15. Почти всегда в life science абсолютные измерения активности не необходимы, и еще важнее получить информацию о относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке либо по элюированным с колонки продуктам; толика субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; толика лиганда, связанного с сенсором; детекция товаров метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и остальные подобные задачки. Потому весьма принципиально, чтоб условия изготовления и измерения образцов в определенном опыте были схожими, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного воздействия на био результаты.
Более ярко эту относительность измерений иллюстрирует обширное внедрение минимониторов — устройств, созданных для определения загрязнения поверхностей рабочих столов, одежки и т.д. Маленькие карманные приборы, имеющие ионизационный счетчик (обычно это ионизационная камера либо счетчик Гейгера), оказались весьма комфортными для детекции меченного фосфором-32 фрагмента ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) в агарозном геле либо меченного йодом-125 белка в ПААГ и т.п. Некие ухитряются по свидетельствам такового устройства оценивать включение меченых предшественников биосинтеза в биополимеры опосля разделения товаров реакции, употребляют мониторы для измерения активности образцов на фильтрах, кусочках фильтровальной либо хроматографической бумаги и даже в пробирках. Это комфортно и полезно для высококачественных и полуколичественных оценок, но следует держать в голове , что приборные ошибки в таковых измерениях могут быть весьма значительными и достигать 200—300%.
Жидкостные сцинтилляционные счетчики уже почти все годы остаются основным инвентарем для количественного измерения радионуклидов в life science. Невзирая на обилие конструкций, исходя из убеждений юзера, они все определяют активность образцов, помещенных в особый стеклянный либо пластмассовый флакон и заполненный водянистым сцинтиллятором. Так как измерение активности сводится к подсчету вспышек света, жидкость во флаконе обязана быть прозрачная для счета и гомогенная по составу. Все отличия от этого требования понижают эффективность счета, при этом время от времени значительно. Образование осадка либо двухфазной несмешивающейся водянистой системы, наличие образцов био тканей либо фильтровальных материалов — все эти причины понижают эффективность счета. То же самое касается добавок почти всех хим веществ: кислот, щелочей, концентрированных смесей сахаров, солей, мочевины и почти все другое. В особенности это касается измерений трития, где разница в эффективности счета для гомогенного, практически безупречного, эталона и эталона, нанесенного на хроматографический сорбент, быть может в 10ч30 раз и даже больше. Это нужно учесть, если при составлении баланса по активности вдруг куда-то пропадет часть радиоактивного материала либо откуда-то в один момент покажется «избыточное».
Составы сцинтилляторов очень многообразны и компании, производящие сцинтилляционные коктейли, нередко не открывают их состав. Традиционный (чуть ли не самым 1-ый) водянистый сцинтиллятор — это толуольный раствор 2,5-дифенилоксазола (РРО) с добавкой 1,4-ди-[2-фенил-(5-окзазолил)]-бензола (РОРОР). Состав: 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л толуола. Не вдаваясь в подробности, следует выделить, что это — неводная система, а водные смеси считать в таком сцинтилляторе не принято. Для измерения аква проб к такому сцинтиллятору добавляют тритон Х-100 до 30% по размеру.
Остальным вариантом «водолюбивого» сцинтиллятора является диоксановый: 60 г нафталина, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирта и до 1 л диоксан марки «сцинтиляционный». Вообщем, большая часть исследователей сейчас удачно пользуются готовыми фирменными коктейлями, справедливо не задумываясь над их составом.
Необходимыми источниками ошибок для жидкостного сцинтилляционного счета являются «засветка» сцинтилляционной воды и электризация счетных флаконов. Оба эффекта просто нейтрализуются во времени (не торопитесь сходу считать, дайте пробам постоять в черном пространстве устройства несколько минут), не считая того, электризация почему-либо почаще проявляется на стеклянных флаконах, и пореже — на разовых пластмассовых.
Внедрение в технологию биоскрининга радиометрических способов анализа подвигло разрабов на создание высокопроизводительных сцинтилляционных счетчиков для измерения активности в планшетах. Для радиоактивных изотопов фосфора устройство употребляется в модификации с наружным жестким сцинтиллятором, который и является сенсором. Для трития жесткий сцинтиллятор добавляют прямо в лунку планшета в виде особых бусинок и, потому что эти бусинки являются сразу компонентом биохимической реакции, то связанный с «бусами» меченый тритием лиганд считается сцинтиллятором, а не связанный, находящийся в растворе, — не считается. С радиохимической точки зрения эффективность счета в таковых измерениях весьма низкая, но для биоскрининга принципиально относительное распределение меченых соединений в системе «связанный-несвязанный», а высочайшая производительность и простота операций оправдывают колоссальные Издержки на реализацию таковых способов.
2.3. Иммиджеры
Весьма полезной и действенной оказалась «электрическая авторадиография», появившаяся сравнимо не так давно, как итог развития микроэлектроники и компьютерной техники.
Фосфоимиджер — устройство для «электрической авторадиографии» фосфора-32. Катушка с неоднократно применяемым экраном экспонируется с плоским прототипом: гелем, хроматографической пластинкой и т.п. Потом экран помещается в устройство, в каком при помощи лазерного сканирования определяется положение и активность радиоактивного материала, экспонировавшегося с экраном.
Иная вариация на данную тему — это внедрение газопроточных счетчиков для «электрической авторадиографии». Представьте для себя щетку для одежки, любой волосок которой поперечником 0,2 мм является личным газопроточным счетчиком. Если вы совместите такую «щетку» общим размером 18 х 24 см с исследуемым плоским прототипом, то на дисплее компа в настоящем времени вы можете следить количественную картину распределения «радиоактивных веществ» на плоскости вашего эталона. Различные модификации такового устройства разрешают работать фактически со всеми радионуклидами, которые используются в life science.
Эффективность счета в этих устройствах, естественно, не быть может высочайшей, но для практической работы в life science этот недочет с лихвой возмещается быстротой и удобством «электрической авторадиографии», также возможностью получения результата сходу в электрическом виде.
3. Систематизация и номенклатура
Все радиоактивные источники с технологической точки зрения делятся на закрытые и открытые. Закрытые источники — это радиоактивные препараты, помещенные в специальную защитную герметичную упаковку (как правило железную), — предусмотрены для работ без вскрытия защитной оболочки.
В молекулярно-биологических и биохимических исследовательских работах употребляют открытые источники — твердые, водянистые либо газообразные радиоактивные вещества либо их смеси. Фактически все радиоактивные препараты, используемые в life science — это смеси соединений, меченных радиоактивными изотопами.
Для обозначения определенного изотопа (в том числе и радиоактивного), согласно правилам номенклатуры, перед хим эмблемой элемента ставится надстрочечное число, обозначающее массу изотопа. к примеру, 14С — изотоп углерода с массой 14. В литературе допускается полное написание хим элемента и его массы через дефис, к примеру, углерод-14. Направьте внимание, что пишется 14С, а произносится обычно С-14, т.е. для хоть какого изотопа при написании первым постоянно указывается общее число изотопа над строчкой, а потом знак хим элемента, а произносят напротив: поначалу элемент, потом масса изотопа.
Соединения, меченные радиоактивными изотопами, делят на две группы веществ. Во-1-х, это определенные хим соединения, у каких один атом (либо несколько) заменён на атом радиоактивного изотопа такого же элемента, т.е. химически такое соединение идентично «немеченому». Во-2-х, это молекулы соединений, измененные при помощи радиоактивного фрагмента (либо доп радиоактивного атома), которые различаются от начального немеченого соединения. К крайнему случаю относятся различные конъюгаты и модификации био макромолекул с неопределенным местоположением радиоактивного атома, к примеру, молекула иммуноглобулина с введенным изотопом радиоактивного йода-125. Наиболее тщательно о этом ниже.
Для обозначения меченых соединений первой группы принято в обыденное хим наименование молекулы вставлять в квадратных скобках наименование изотопа, которым мечено соединение, и его пространство в молекуле перед заглавием части молекулы, содержащей меченый атом. В качестве примера ниже приведены наименования тимидин-5′-трифосфата, меченного разными радионуклидами и в различных положениях:
16. [6-3H] тимидин-5′ трифосфат
17. [метил-3H] тимидин-5′ трифосфат
18. [U-3H] тимидин-5′ трифосфат
19. [5′-3H] тимидин-5′ трифосфат
20. [6,2′,3′-3H] тимидин-5′ трифосфат
21. [2-14С] тимидин-5′ трифосфат
22. [U-14С] тимидин-5′ трифосфат
23. тимидин -5′ [б-32P] трифосфат
24. тимидин -5′ [г-32P] трифосфат
В примерах 3 и 7 пространство радиоактивного атома в молекуле обозначено U — это значит, что четкое пространство радиоактивного атома непонятно и, может быть, речь идет о умеренно меченой молекуле. Обычно такое бывает, если метод получения соединения заключался в выращивании мельчайшего организма на среде, обогащённой мотивированным изотопом, с следующим выделением подходящего соединения из клеточного лизата. Подробнее способы получения меченых соединений дискуссируются в остальных разделах. В примерах 8 и 9 б и г — это не тип радиоактивного распада, а положение радиоактивных атомов фосфора-32 в трифосфатной группе.
Для наименования 2-ой группы соединений обозначение радионуклида в квадратных скобках выносят перед наименованием молекулы: [125I]-альбумин — альбумин, меченный йодом-125 либо [метил -3H]-альбумин — альбумин, меченный тритием за счет метилирования молекулы [3H]-метильной группой йодистого метила.
4. Главные радионуклиды в life science
Перечень радиоактивных изотопов, которые употребляются в life science, совершенно очень ограничен самой природой. В состав органических соединений входят водород, углерод, кислород, азот, также еще пореже фосфор и сера. Как следует, для получения немодифицированных меченых соединений круг вероятных радионуклидов ограничен этими биогенными элементами. Их свойства приведены в таблице 1.
Радионуклид
Период полураспада
Удельная активность 100% изотопа
Тип распада
Энергия(max) [MeV]
[mCi/mmol]
[Бк/моль]
3H (тритий)
12.43 года
29.05
1,11×1015
в
0.0185
14C
5730 лет
0,062
2,3х1012
в
0.156
32P
14.3 дней
9104
0,33х1018
в
1.709
33P
25.4 дней
5138
0,19х1018
в
0.249
35S
87.4 дней
1491
0.5х1017
в
0.167
125I
60 дней
2167
0,8х1017
e.c.
0.25
К огорчению, радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совсем неприемлемый для работы в life science период полураспада — от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже используются в медицине и технике, но их внедрение в физико-химической биологии очень проблематично.
Список радионуклидов, которые могут употребляться (и употребляются) для получения измененных молекул, быть может значительно расширен. Такие измененные молекулы нередко употребляются не только лишь в life science, да и в медицине (как для диагностики, так и для процесс). Очень популярны для медико-биологических работ радионуклиды технеция, хрома и остальных. В этом материале не будут рассматриваться мед нюансы внедрения меченых соединений, потому сосредоточимся на использовании радионуклидов, приведенных в таблице 1.
Следует увидеть, что все радионуклиды из таблицы 1 являются в-излучателями, не считая 125I, который «затесался» в этот перечень быстрее в символ «особенных наград», о которых ниже будет отдельная глава. По сути 125I для меченых соединений фактически не употребляется, потому что в {живых} организмах особенного контраста молекул, содержащих йод, не наблюдается.
Совершенно, «безупречный радионуклид» для life science должен отвечать последующим аспектам:
· Элемент должен заходить в состав всех органических молекул. Это понятно, потому что делает вероятным введение «меченого атома» в всякую молекулу.
· Период полураспада «безупречного радионуклида» 10ч100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в спектре 1018ч1017 Бк/моль и сумеет обеспечить высшую чувствительность способа.
· Незапятнанный в-излучатель с наибольшей энергией излучения не наиболее 0,4 Мэв.Это дозволяет сравнимо просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высочайшее разрешение способов, связанных с авторадиографической детекцией меченых товаров.
К огорчению, ни один из приведенных в таблице радионуклидов не соответствует «эталону». Тритий и углерод имеют очень большенный период полураспада, т.е. низкую молярную активность (в особенности, углерод), а весьма низкая энергия излучения трития очень осложняет его детекцию и радиометрию. Очень комфортные ядерно-физические свойства радиоактивных изотопов фосфора и серы не могут восполнить ограниченность распространения этих частей в органических молекулах. Потому выбор радионуклида, который предполагается применять для исследования, приходится созодать с учетом различных причин, которые тщательно разбираются ниже.
Все приведенные в таблице радионуклиды — искусственные, реакторные изотопы. В природе есть радиоактивные изотопы 3H и 14C, но их содержание весьма низкое, и препаративное выделение таковых изотопов как сырья для синтеза меченых соединений является задачей с экономической точки зрения полностью разорительной. Коротко методы получения радионуклидов из таблицы 1 будут сообщены в соответственных разделах.
5. Технические свойства меченых соединений
Все препараты меченых соединений, которые употребляются в life science, имеют технические свойства, тщательно обозначенные фирмой-производителем в паспорте (сертификате) и коротко — на флаконе с продуктам. Ниже тщательно разбираются определения технических черт и их
5.1. Радионуклидная чистота [ % ]
Это черта радиоизотопной чистоты продукта. Для большинства радионуклидов, используемых в life science, не весьма принципиальна. Примеси остальных радионуклидов в тритиевых либо 35S соединениях отсутствуют. Но, для соединений, меченных фосфором-33, это важная черта, т.к. нередко наличие примеси фосфора-32 наиболее 2ч3% делает продукт фосфора-33 очень непонятным по качеству исходя из убеждений почти всех методик.
время от времени фирмы-производители искусственно «подогревают» Энтузиазм биохимиков к продуктам с весьма высочайшей радионуклидной чистотой. к примеру, у йода много радиоактивных изотопов со своими персональными ядерно-физическими чертами. Самый пользующийся популярностью в life science радиоизотоп йода — 125I. Компания»Амершам» (Amersham) весьма гордится тем, что дает исследователям 125I с весьма высочайшей радионуклидной чистотой — содержание примесного 126I наименее 0,01%. В то же время, фактически для всех исследовательских работ в life science, включая радиоиммуноанализ, эта черта не является принципиальной, и содержание остальных радиоактивных изотопов йода в мотивированном 125I быть может 0,1% и даже 1% без какого-нибудь вреда для био осмысления приобретенных результатов.
5.2. Радиохимическая чистота [ % ]
Радиохимическая чистота (РХЧ) — это содержание основного вещества, которое определяется обычно хроматографически (ВЭЖХ либо ТСХ) в 2-ух различных системах (критериях). Как правило, РХЧ не ниже 95%. Для большинства исследователей в life science РХЧ начинает представлять Энтузиазм, когда они «угробили» опыт и пробуют осознать почему это вышло.
5.3. Большая активность [МБк/мл (мКи/мл)]
время от времени объемную активность именуют концентрацией радиоактивности (radioactive concentration), что полностью отражает сущность. На все производимые меченые соединения в паспорте (сертификате) непременно указывается дата паспортизации и «reference data» — дата, на которую дается очень большенный расход материала. Так что исследователи просто рассчитывают нужную им для работы активность, исходя их данных паспорта с учетом периода полураспада применяемого радионуклида. естественно, что учет распада радионуклида проводится для короткоживущих радиоактивных изотопов: фосфора, серы и йода, а для трития, и тем наиболее для 14С этого не делают.
5.4. Молярная активность [Бк/моль (Ки/ммоль)]
Молярная активность — это активность 1-го моля вещества, содержащего некий радионуклид. Устаревшие единицы измерения Ки/ммоль как и раньше употребляются и даже почаще, чем современные Бк/моль. Это просто удобнее, т.к. величина высочайшей молярной активности (к примеру, фосфора-32), выраженная в Бк/моль, нередко вызывает у биологов панику. Сравните: 5000 Ки/ммоль равно 1,85х1017 Бк/моль.
В забугорной научной литературе почаще употребляется термин «специфичная активность» (specific activity), который является синонимом молярной активности.
В русской литературе существует термин «удельная активность» — активность 1-го грамма (время от времени микрограмма) вещества, содержащего радионуклид. Обычно таковая черта дается соединениям, молекулярный вес которых не определен либо не известен. к примеру, препараты биополимеров (ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов), РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов), белков) обычно охарактеризовывают удельной активностью — активностью 1-го микрограмма вещества. В английской литературе термин «специфичная активность» (specific activity) значит и молярную, и удельную активность.
Молярная активность — важная черта меченого соединения, при этом по нескольким причинам.
Во-1-х, вы сможете оценить долю фактически меченых соединений в препарате, предложенном для вас для работы. К примеру, если продукт L-[35S]-метионина имеет молярную активность 300 Ки/ммоль, то, беря во внимание теоретическую молярную активность (1491 Ки/ммоль) для серы-35, несложно подсчитать, что в препарате лишь 5-ая часть молекул содержит изотоп 35S (300 : 1491 = 1/5), а другие — «прохладные» молекулы — не содержат радиоактивных атомов. Во-2-х, можно подсчитать молярную концентрацию меченого продукта. Для этого нужно поделить объемную активность продукта (Ки/мл) на его молярную активность (Ки/ммоль) и получить концентрацию вещества в растворе в ммоль/мл (моль/л). Лишь будьте внимательны к единицам и множителям, чтоб не поделить объемную активность в мКи/мл на молярную активность в Бк/моль (либо напротив).
В-3-х, вы сможете оценить максимально достижимую для вашего продукта чувствительность обнаружения соединения. Так, если ваш продукт [г-32P] ATP имеет молярную активность 1000 Ки/ммоль, то, беря во внимание границу достоверной количественной регистрации фосфора-32 в 10-10 Ки, вы можете найти 10-10 / 103= 10-13 ммоль, т.е. 10-16 моль вещества. К огорчению, эта восхитительная чувствительность на практике нередко остается недосягаемой, т.к. в количественных измерениях в life science обычно «био фон» опыта еще выше физического либо приборного. Это тщательно будет дискуссироваться на примере использования соединений, меченных фосфором-32.
Следует выделить один весьма увлекательный парадокс, связанный с молярной активностью. Если молярная активность меченого продукта близка к на теоретическом уровне вероятной (наиболее 90% от наибольшей), то, независимо от периода полураспада радионуклида, величина молярной активности продукта будет фактически неизменной. Это отлично видно на примере 33Р-ортофосфорной кислоты с молярной активностью около 5000 Ки/ммоль. Вправду, согласно схеме радиоактивного распада фосфор-33 преобразуется в серу-33 и, как следует, вкупе с убыванием количества радиоактивных атомов (распадом) убывает (миниатюризируется) количество молекул фосфорной кислоты, т.к. из фосфорной H333РO4 появляется серная (H233SO4).
6. Радионуклид 3Н (тритий)
Тритий — радиоактивный изотоп водорода, «незапятнанный» в-излучатель, который просто нарабатывается в реакторе в значимом количестве.
Схема распада: 3Н —> e + 3He
Для life science тритий является самым нужным и комфортным радионуклидом по нескольким суждениям. Во-1-х, фактически всякую органическую молекулу можно пометить тритием (только бы содержала водород). Во-2-х, тритий просто вводится в различные соединения, и химия этих действий разработана лучше, чем для хоть какого другого радионуклида. В-3-х, тритий — это самый дешевенький радионуклид, из применяемых в life science. Есть красивая подробная монография по синтезу соединений, меченных тритием, (В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Н.Ф. Мясоедов, «Меченные тритием липофильные соединения» Москва, изд. «Наука» 2003г.), потому я лишь коротко перечислю главные способы получения 3Н-соединений.
28. Хим синтез гидрированием 3Н2 ненасыщенных связей, дегалоидирование и восстановление гидроксильных либо карбонильных соединений.
29. Каталитический либо термоактивированный водородный обмен.
30. Модификация соединений при помощи 3Н-метильных либо 3Н-ацетильных групп.
31. Гидрирование Li[B3H4] либо Li[Al3H4]
32. Введение 3Н за счет тритиевой воды (гидролиз либо обмен).
33. Ферментативный синтез из 3Н-меченых предшественников.
Можно добавить биосинтез — выкармливание микробов на среде, содержащей 3Н-предшественник (к примеру, [метил-3H] тимидин, для получения меченой ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов)), с следующим выделением мотивированного соединения. Но, этот метод довольно специфичный и обычно применяется лишь в лабораторной практике для получения биополимеров.
Исторически так сложилось, что меченые тритием составляющие нуклеиновых кислот и аминокислоты стали инструментами для нескольких поколений ученых. Позже к тритию добавился фосфор-32 (и фосфор-33) для нуклеиновых кислот и сера-35 для белков, и толика работ с тритием в этих направлениях снизилась.
Для исследователей липидов, простагландинов, гормонов, углеводов, лекарств, витаминов и почти всех остальных классов соединений, тритий — основной (нередко единственно доступный) инструмент увеличения чувствительности способов. Это касается исследовательских работ рецепторов, модуляторов и совершенно «сигнальных» систем организмов. Потому тритий, не имеющий пока особенных альтернатив, как и раньше, остается главным «рабочим» радионуклидом в life science.
Основным недочетом трития является трудность его детекции и количественного измерения из-за очень «слабенького» в-излучения. Более действенный метод измерения — жидкостной сцинтилляционый счет, о котором наиболее тщательно дана информация в разделе 2.2. Особо следует выделить, что конкретно для трития понижение эффективности счета («гашение») играет существенную роль в количественных измерениях.
Авторадиография тритиевых соединений тоже имеет ряд специфичных особенностей. Ровная детекция в-излучения трития фоточувствительным материалом — процесс весьма длинный и употребляется изредка. Зато была предложена уникальная модификация, согласно которой эталон, содержащий тритий, обрабатывается сцинтилляционными субстанциями, и авторадиография преобразуется в своеобразную «автофлюорографию». Для пластинок ТСХ — это опрыскивание веществом РРО, который уже упоминался в разделе «жидкостной сцинтилляционный счет». Опосля высушивания таковая пластинка экспонируется с рентгеновской плёнкой, и дальше — как обычно.
Для ПААГ предложена процедура пропитки геля этим же РРО. Поначалу приходится заместить воду в геле на диметилсульфоксид (DMSO), т.к. РРО нерастворим в воде. Потом гель пропитывают веществом РРО в DMSO, опосля чего же назад замещают DMSO на воду (РРО выпадает в геле в осадок и гель становиться белоснежным). Опосля всех этих процедур гель высушивают и выставляют с рентгеновской пленкой. «Занудность» этих операций окупается сторицей — выходит возможность детекции товаров, меченных тритием, (к примеру пептидов, меченных 3Н-лейцином) сходу опосля электрофореза в ПААГ.
Еще одна «пикантная» сторона использования соединений, меченных тритием, — это хим стабильность таковых соединений. Как ни удивительно на 1-ый взор, но радиолиз — хим разрушение молекул под действием ионизирующего излучения — конкретно для соединений трития играет очень существенную роль. Это принципиально держать в голове, т.к. большенный период полураспада (12 лет) типо дозволяет применять синтезированные вещества в течение месяцев ( а время от времени и лет) с момента паспортизации. Тут нужно быть весьма усмотрительным, т.к. нередко при некорректных критериях хранения заместо мотивированного соединения остается сложнейшая смесь товаров радиолиза, где подходящего соединения не наиболее трети. Обычная ошибка — хранение аква раствора тритиевого соединения в замороженном виде. В замороженном виде высокомеченные тритием соединения «рассыпаются» еще резвее, чем в растворе. Потому для долгого хранения меченых тритием соединений при -20°С непременно добавляют спирт либо иной «антифриз», препятствующий замерзанию раствора.
С хим стабильностью соединений трития связана еще одна неувязка. Устойчивость хим связи водорода (хоть какого изотопа водорода) с иными атомами в молекуле зависит от природы данной связи. Соответственно, возможность обмена водорода в молекуле меченого соединения с растворителем, к примеру с водой, непременно нужно учесть. Водород карбоксильной группы в воде за счет электролитической диссоциации обменивается одномоментно, а водород в алкильном либо арильном фрагменте молекулы обменивается весьма тяжело — при обычных критериях обмена нет. Меж этими «последними» примерами находится большущее обилие молекул с разной способностью к «водородному обмену», и для различных биохимических действий вопросец о стабильности тритиевой метки быть может либо очень животрепещущим либо совсем несущественным.
7. Радионуклид 14C
Радионуклид 14C получают облучением нитрида алюминия по реакции:
14N + 0n —> 14C + 1p
в виде 14C-карбида. Из него 14C выделяют в виде 14CО2, который обычно поглощают Ba(OH)2, и приобретенный 14C-карбонат является главным радиоактивным сырьем для всех синтезов 14C-соединений. Всё богатство 14C-меченых соединений в каталогах различных фирм синтезируется 2-мя способами:
34. Биосинтез. В питательную среду к микробам (обычно это водные растения типа хлореллы) добавляют 14CО2 в качестве единственного источника углерода. Опосля выкармливания из биомассы выделяют умеренно меченые 14C-соединения. Таковым методом получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные составляющие и остальные природные соединения. время от времени 14C-биомассу водных растений употребляют как источник углерода (собственного рода меченый пептон) для выкармливания штамма-продуцента какого-либо принципиального соединений.
35. Хим синтез. Синтез всего обилия органических веществ из карбоната — традиционная задачка органической химии. Именитые цепочки перевоплощений органических соединений (ужас почти всех поколений студентов и школьников) полностью реализованы в синтезе 14C-соединений. Все органические соединения, которые не удается получить биосинтезом, синтезируют химически.
Схема распада углерода-14: 14C —> 14N + e. Хотя с детекцией 14C особенных заморочек не возникает, применение 14C-соединений в life science очень ограничено. Это соединено с весьма низкой молярной активностью 14C-соединений, и даже кратно меченые молекулы не меняют ситуацию конструктивно. Обычно молярная активность 14C-соединений не превосходит 20ч50 мКи/ммоль, (у соединений трития практически в 1000 раз выше, а у фосфора-32 либо 33 еще в 100 раз выше) и, как следует, по чувствительности способы с внедрением 14C-соединений существенно уступают способам, в каких употребляют 3Н-соединения. На нынешний денек 14C-соединения крепко задерживают за собой лишь одну «нишу» в life science — это исследование метаболизма новейших фармацевтических (либо косметических) препаратов. Для исследования деградации, скопления в органах, скорости и путей выведения, биодоступности и иных качеств метаболизма умеренно меченые 14C-соединения остаются нужными, невзирая на весьма высшую стоимость и трудозатратность синтеза.
8. Радионуклиды 32P и 33P
Радионуклиды 32P и 33P — весьма комфортны для life science, но их применение ограничено природой, т.к. фосфор в природных органических соединениях находится еще пореже, чем водород, углерод либо кислород.
Получение радиоактивных изотопов фосфора (32Р и 33Р) в техническом плане идиентично: облучение простой серы особенной чистоты в атомном реакторе.
Но, с экономической точки зрения разница грандиозная. Дело в том, что 32Р получают по реакции 32S + 0n —> 32P + 1p в виде 32P-ортофосфата. Стартовый материал мишени — природная простая сера, содержащая наиболее 92% размеренного изотопа 32S. Изотоп 33Р получают по реакции 33S + 0n —> 33P + 1p также в виде 33P-ортофосфата. Но мишенью для данной реакции служит изотоп 33S, содержание которого в природе составляет толики процента. Для получения 33Р высочайшего свойства нужно применять для облучения лишь 33S с обогащением не ниже 98,5ч99,0%. Это сходу значительно наращивает стоимость продукта, т.к. стоимость обогащенной серы-33 больше природной серы приблизительно на 6 порядков (в миллион раз). Потому соединения фосфора-33 постоянно будут дороже подобных соединений, меченных фосфором-32.
Схемы распада радионуклидов фосфора : 32P —> 32S + e и 33P —> 33S + e
Начальным радиоактивным сырьем для получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, постоянно является ортофосфорная кислота (32Р либо 33Р соответственно). Потому что химия и биохимия 32Р и 33Р полностью схожи, в предстоящем пойдет речь о фосфоре-32, с учетом того, что все это распространяется и на фосфор-33. В особенных вариантах, когда нужно, будут отмечаться различия. Фактически сама 32Р-орто-фосфорная кислота в life science употребляется изредка. Обычно это выкармливание микробов (микробов либо дрожжей) либо культуры клеток в среде, содержащей 32Р-ортофосфат. Полученную меченую биомассу отделяют от культуральной воды, а потом изучат. несколько замечаний по этому процессу.
36. Начальная 32Р-ортофосфорная кислота без носителя (этот термин значит, что в продукт не добавляли специально нерадиоактивную ортофосфорную кислоту) имеет молярную активность не наименее 5000 Ки/ммоль, и, соответственно, концентрация фактически фосфата в среде лишь за счет радиоактивного фосфора будет не выше 10-8 М. Для био (микробиологических) работ таковая концентрация фосфата в среде очень низкая — клеточки будут «считать», что фосфора нет совершенно. Потому в культуральную среду непременно добавляется «прохладный» фосфат в концентрации, нужной для усваивания. Обычно это не ниже 10-4 М. Не пытайтесь «включить» радиоактивный фосфат в культуру клеток без «прохладного» носителя. часть радиоактивного фосфата просто сорбируется на поверхности посуды либо клеток, а включения в клеточный обмен не произойдет.
37. Лучшая концентрация фосфата для таковых тестов подбирается персонально для различных задач и видов клеток. «Переносить» данные по хорошей концентрации с 1-го вида тестов (либо клеток) на иной нужно осторожно.
Главными соединениями фосфора-32, используемыми в life science, являются нуклеозид-5′-трифосфаты, меченные в альфа либо палитра положении. В конце 60-х — начале 80-х годов ХХ века было создано несколько методов синтеза этих соединений, но опосля работы Джонсона и Валсеса, предложенный ими ферментативный метод стал рутиной как для лабораторного синтеза, так и для масштабного производства. Хим способы синтеза меченных фосфором-32 соединений употребляются, когда нет ферментативного пути, к примеру для синтеза синтетических аналогов нуклеотидов.
]]>