(4 оценок, среднее: 4,75 из 5)
Загрузка...
Учебная работа. Аденилатциклазный сигнальный механизм
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора био наук
Санкт-Петербург 2007
Актуальность задачи
Исследование производящиеся в специализированных клеточках желёз внутренней секреции»> вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции»>гормональных (Гормоны греч. возбуждаю, побуждаю — биологически активные вещества, вырабатывающиеся в специализированных клетках желёз внутренней секреции) сигнальных систем, участвующих в регуляции актуально принципиальных для организма клеточных действий, является одной из животрепещущих заморочек современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного деяния веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клеточке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по последней мере, из 3-х молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри, способные принимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (G-белки) стимулирующего (Gs) либо ингибирующего (Gi) типа, состоящие из 3-х субъединиц — ?, , ? и обеспечивающие сопряжение меж сенсором и третьим компонентом системы — ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование всепригодного внутриклеточного посредника — повторяющегося аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клеточке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).
К истинному времени в литературе накоплен значимый размер данных, свидетельствующих о участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих собственный эффект на клеточку через нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках реального исследования мы предприняли попытку узнать возможность роли АЦС в реализации деяния пептидов инсулинового суперсемейства, владеющих сенсорами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клеточки. До исследовательских работ, проведенных нами, роль системы АЦС-цАМФ в реализации деяния гормонов инсулиновой природы фактически отрицалось. В литературе имелись только отдельные сведения о воздействии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Невзирая на успехи, достигнутые за крайние десятилетия в исследовании молекулярных устройств деяния инсулина и инсулиноподобных пептидов, почти все нюансы плейотропного деяния этого гормона и схожих ему пептидов до сего времени остаются невыясненными (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). В связи с сиим исследование ранее неведомых молекулярных устройств деяния пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в истинное время около 50 представителей, относится к числу животрепещущих заморочек современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и схожие ему пептиды играют главную роль в регуляции ряда клеточных действий — клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, потому что появились в процессе эволюции из общего анцестрального гена в итоге дупликации и следующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при всем этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992).
К исследованию роли АЦС в реализации деяния гормонов и ростовых причин инсулиновой природы лаборатория приступила сначала 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, в первый раз приобретенные нами, о возможности инсулина и схожих пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы употребляли эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было исследовано: 1) воздействие на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) воздействие на АЦС пептидов в тканях-мишенях звериных различного филогенетического уровня (позвоночные — крысы, птицы и беспозвоночные — моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных зародышей различного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.
Цель работы. Обосновать роль аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клеточке и расшифровать структурно-функциональную компанию АЦ сигнального механизма их деяния в тканях позвоночных и беспозвоночных, также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции базовых клеточных действий — клеточный рост, апоптоз.
Задачи исследования
1. Изучить действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для доказательства вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.
2. Изучить структурно-функциональную компанию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и узнать последовательность шагов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С данной нам целью: а) установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм деяния пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и способ АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить роль фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-3-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.
3. Изучить роль АЦ сигнального механизма деяния инсулина и ИФР-1 в регуляции действий клеточного роста и апоптоза, исходя из догадки о принципиальной роли цАМФ в регуляции базовых действий в клеточке (Перцева, 2000).
4. Изучить многофункциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии — сладкий диабет 1-го и 2-го типов.
Научная новизна
В первый раз найдено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано роль рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков (Gi) и (Gs) типа в реализацию активирующего деяния этих пептидов на АЦ. В первый раз показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС — ПКС и может быть ПКС?.
В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных звериных найден ранее неведомый АЦ сигнальный механизм деяния инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клеточке последующей сигнальной цепью: сенсор тирозинкиназного типа Gi-белок (?-димер) ФИ-3-К ПКС (позвоночные) либо ПКС? (беспозвоночные) Gs-белок АЦ цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) эффекторные системы. Этот механизм различается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма деяния гормонов, владеющих сенсорами серпантинного типа, представленного в клеточке последующей цепью: сенсор серпантинного типа G-белок (Gi либо Gs) АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы.
Необходимо подчеркнуть, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, схожий с таким позвоночных, но имеющий на пострецепторных шагах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных воспринимает роль ПКС?, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, — ПКС?.
Экспериментально доказана, выдвинутая нами догадка, о принципиальной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного деяния инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клеточке. Показано роль АЦ-цАМФ системы в возможности ИФР-1 и инсулина провоцировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток.
Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме деяния инсулина при патологии (сладкий диабет 1-го и 2-го типов).
Теоретическое и практическое
Теоретическое и практическое
Применение эволюционного подхода (исследование ряда эволюционно-родственных пептидов и внедрение представителей позвоночных и беспозвоночных) позволило выявить консервативность найденного АЦ сигнального механизма деяния пептидов инсулиновой природы.
Данные, приобретенные на беспозвоночных, могут быть полезны для осознания сигнальных устройств деяния пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека (сладкий диабет) в рамках новейшего направления — «эволюционная биомедицина» (Перцева, 2006).
Приобретенные данные о молекулярных механизмах деяния инсулина и ИФР-1 имеют базовое
Результаты исследования имеют принципиальное практическое работоспособности»>заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности)
. Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм деяния инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме деяния инсулина.
Положения, выносимые на защиту
1. В первый раз установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) звериных.
2. Реализация АЦ активирующего деяния пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий последующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) ФИ-3-К ПКС Gs-белок АЦ.
3. С ролью АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы — стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз.
4. При эндокринной патологии (сладком диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма деяния гормонов инсулиновой природы в главном на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.
5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма деяния пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных звериных свидетельствует о его эволюционной консервативности.
Апробация работы
Главные результаты и положения работы были представлены и доложены на последующих конференциях и съездах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Евро Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн, Германия, 2002); 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона, 1997); XXXIII Интернациональный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997); 2-й съезд Биохимического Общества ран (Москва, 1997); XVII съезд физиологов Рф (Ростов на дону-на-Дону, 1998); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 1998); Съезд Биохимического общества Института Глазго (Глазго, Англия, 1999); 18-ый Интернациональный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Великобритания, 2000); 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и схожем пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США (Соединённые Штаты Америки — имени И.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии (Физиология от греч. — природа и греч. — знание — наука о сущности живого) (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Интернациональная Европейская конференция (Люксембург, 2002); 2-ая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвященная 80-летию со денька рождения М.Г. Колпакова. (Новосибирск. Октябрь, 2002); 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Содружество Независимых Государств — региональная международная организация (международный договор), призванная регулировать отношения сотрудничества между государствами, ранее входившими в состав СССР) (Сочи, Дагомыс, 2005);
Публикации. По теме диссертации размещено 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых российских и интернациональных изданиях.
Личный вклад создателя — Экспериментальные данные получены лично создателем либо при его конкретном участии.
структура и размер диссертации. Диссертация изложена на 259 страничках, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и способов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и перечня литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами.
Основное содержание работы
Объекты и способы исследования. Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных — крысы Ratus norvegicus полосы Wistar; 2) куры породы российская белоснежная «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных — пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea; 4) ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) позвоночных и беспозвоночных звериных с внедрением способа дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);
— выделение отчасти очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных зародышей, фибробластоподобных клеток полосы Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);
— выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).
— определение активности АЦ с внедрением радиоактивного субстрата АЦ реакции — [?32P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некими модификациями);
— определение активности цАМФ-ФДЭ, с внедрением радиоактивного субстрата [3H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);
— АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);
— электрофорез в ПААГ
— иммуноблотинг с внедрением моноклональных кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);
— внедрение модели апоптоза на трансформированных клеточках, приобретенных из обычных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, владеющих высочайшей проапототической чувствительностью к удалению ростовых причин (Bulavin et.al., 1999) и ее черта (Плеснёва и др., 2003);
— оценка антиапоптотического деяния инсулина, ИФР-1 и цАМФ с внедрением способа клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras (Плеснёва и др., 2003);
— определение активности ферментов углеводного метаболизма — гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);
— определения содержания белков способом Лоури;
— сотворения моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (способы обработки данных по программкам (Statgraph и Anova).
Результаты исследования и их обсуждение
В работе представлены экспериментальные подтверждения активирующего деяния инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клеточке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.
Главные этапы работы состояли в исследовании:
— деяния пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo;
— роли примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма деяния инсулиноподобных пептидов;
— звеньев АЦ сигнального механизма (от сенсора до эффекторных систем);
— роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных действий, так и его многофункционального внедрения в критериях патологии;
Воздействие in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в различные временные сроки
Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10-8М и для сопоставления эпидермального ростового фактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, владеющего сенсором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987). Показано, что в мембранной фракции скелетных мускул крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236%. Эффект наименее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска +124% (Рис. 1; Таблица 1).
Рис. 1. Концентрация пептидов — 10-8М Активация АЦ пептидами (в%) по сопоставлению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)
Таблица 1. Динамика во времени деяния ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мускул крыс
Действия
Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
2.5 мин
5 мин
10 мин
Без ИФР-1
71.2±4.8
(100%)
85.11±3.3
(100%)
101.20±9.24
(100%)
+ ИФР-1
214.31±12.1
(301%)
136.16±5.2
(160%)
96.14±4.6
(95%)
Примечание: В скобках — базальная активность АЦ (без действий), принятая за 100% и активность АЦ (в%) при действии ИФР-1
В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис. 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5 мин составляет +256%, по сопоставлению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, приобретенными на мембранной фракции скелетных мускул крыс (+236%) (рис. 1).
В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает более выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сопоставлению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис. 3; Таблица 2). Необходимо подчеркнуть, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в большей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин понижается, а через 10 минут фактически отсутствует (Таблица 2; Рис. 3).
Рис. 2. Концентрация инсулина 10-8М. Различия достоверны (р<0.05)
Таблица 2. Динамика во времени деяния ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мускул моллюска
Действия
Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
2.5 мин
5 мин
10 мин
Без ИФР-1
110.21±10.8
(100%)
125.31±9.3
(100%)
106.04±6.6
(100%)
+ ИФР-1
259.92±11.4
(269%)
229.31±5.2
(183%)
103.81±5.8
(98%)
Примечание — как в таблице 1.
Таковым образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых звериных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов зависимо от времени деяния. Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с наибольшим эффектом через 2.5 мин. АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их воздействию на АЦ имеет последующий порядок: инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска — ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин.
Рис. 3. Концентрация пептидов — 10-8 М Активация АЦ пептидами (в %) по сопоставлению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)
Влияние in vivo различных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в различные временные сроки
Найдя в опытах in vitro стимулирующее воздействие пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ, мы изучили воздействие инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность АЦ в различных дозах и при разном времени деяния в критериях in vivo. Опыты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных зародышей и моллюсков опосля введения инсулина (внутрибрюшинно либо внутрижелточно) в дозах 0.05 нг/г-10 нг/г веса тела (вес крысы либо куриного зародыша, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, применяемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов in vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина (+222%) выявляется через 5 мин опосля введения гормона (1 нг/г), а через 15 мин он понижается практически втрое (67%) (Рис. 4). При наиболее высочайшей дозе инсулина (10 нг/г), стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее (+124%), а через 15 мин отсутствовал.
Рис. 4. Активация АЦ пептидами (в %) по сопоставлению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)
В опытах in vivo в мембранных фракциях мускул куриных зародышей различного возраста найден АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных зародышей он выявлялся уже через 5 мин, наиболее верно выражен через 15 мин, а через 30 мин не проявлялся (рис. 5).
Рис. 5. Различия достоверны (р<0.05)
У 17-дневных куриных зародышей выявлено дозозависимое активирующее действие инсулина на активность АЦ через 5 минут (Рис. 6), которое слабеет через 15 и 30 мин опосля введения гормона.
Рис. 6. Различия достоверны (р<0.05)
При внедрении моллюскам инсулина (0.5 нг/г и 5.0 нг/г) активность АЦ росла через 5 мин опосля введения гормона на +49% и +381%, соответственно, по сопоставлению с контролем, принятым за 100%. Через 20 мин воздействие гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ понижается (+22%) и фактически исчезает (+6%) через 40 мин (Рис. 7). При внедрении инсулина (5 нг/г) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мин составлял +110%, а через 40 мин +50% (рис. 7).
Рис. 7. Светлые столбики — базальная активность АЦ. Заштрихованные столбики — инсулин-стимулированная активность АЦ при различных дозах гормона. Различия достоверны (р<0.05)
Из приобретенных нами данных следует, что ясное воздействие инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Рис. 7) выявляется при наиболее высочайшей дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно разъяснить тем, что у моллюска A.cygnea нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1 — подобные нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри либо сенсоры ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее воздействие инсулина на АЦ (Шпаков и др., 2005).
Необходимо подчеркнуть, что проявление АЦ стимулирующего воздействия инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах in vitro и in vivo. АЦ активирующий эффект пептидов ясно выявляется при маленьких сроках воздействия пептида (2,5 и 5 мин) при физиологических концентрациях (10-9-10-8М), с повышением времени деяния эффект пептидов слабеет либо отсутствует.
АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР—1 и ИПП при различных концентрациях в критериях in vitro
Установив наилучшее время деяния пептидов инсулинового суперсемейства, при котором происходит активация АЦС (2.5 мин), нужно было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов более выражен. В различных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичные нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри, отличающиеся по сродству к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях.
Проведено исследование воздействия инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2.5 мин при различных концентрациях (10-12-10-6М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов.
В мембранной фракции скелетных мускул крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП находится при концентрациях — 10-11-10-7М (Рис. 8). Более выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет: для инсулина +250% при 10-8М; для ИФР-1 +91% при 10-9М; для ИПП +111% при 10-8М; для ЭФР +190% при 10-10М. (Рис. 8).
Можно отметить, что в спектре концентраций 10-10-10-7М более верно выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты остальных исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при наиболее низких концентрациях (10-11-10-10М).
Рис. 8. Базальная активность АЦ принята за 100%. время деяния пептидов 2.5 мин
Таблица 3. Воздействие in vitro различных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных зародышей различного возраста и цыплят
Объекты (возраст)
10-сут
Зародыши
13-сут
Зародыши
16-сут
Зародыши
Цыплята
3-сут
действия
Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка)
В скобках — Активность АЦ (в%) в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100%.
Без
Инсулина
14.021.10
(100%)
3.900.45
(100%)
2.010.09
(100%)
8.520.41
(100%)
+инсулин
10-11 М
16.341.35
(117%)
4.210.34
(108%)
4.810.46
(239%)
10.110.55
(119%)
+ инсулин
10-10 М
39.141.93
(279%)
10.330.89
(265%)
5.280.30
(263%)
11.240.48
(132%)
+ инсулин
10-9 М
48.252.21
(344%)
15.921.24
(408%)
10.240.62
(509%)
14.540.82
(171%)
+ инсулин
10-8 М
19.871.44
(142%)
9.840.56
(252%)
9.920.47
(494%)
19.551.13
(238%)
+ инсулин
10-7 М
17.130.98
(122%)
4.930.45
(126%)
7.510.33
(374%)
22.211.37
(261%)
+ инсулин
10-6 М
17.901.12
(128%)
5.120.21
(131%)
1.950.22
(97%)
24.391.62
(286%)
исследование АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить последующие факты. Более выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10-11М-10-6М находится у куриных зародышей (10, 13, 16 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10-9М, и составляет у 10-суточных зародышей +244%, у 13-суточных +308%, у 16-суточных +409% (Таблица 3), а у 3-х дневных цыплят (+186%) при наиболее высочайшей концентрации 10-6М, что быть может соединено с переходом зародышей в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки завершаются.
Проведенные нами исследования деяния инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й денек развития) проявили, что больший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+352%) выявляется при концентрации 10-9М, а ИФР-1 (+289%) при концентрации 10-10М (данные в диссертации).
В мембранной фракции мускул моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях — 10-11-10-8М (Рис. 9). Инсулин и ИФР-1 оказывают более выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10-8М (+63% и +54%, соответственно), а ИПП и ЭФР при 10-9М (+415% и +223%, соответственно).
Таковым образом, определен спектр концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Необходимо подчеркнуть видоспецифичность деяния пептидов. действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска A.cygnea, является наиболее действенным в ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) моллюска и наименее действенным в тканях позвоночных.
Рис. 9. Базальная активность АЦ принята за 100%. время деяния пептидов — 2.5 мин.
Участие ц—АМФ-зависимой ФДЭ в механизме деяния пептидов инсулинового суперсемейства
Уровень цАМФ в клеточке зависит не только лишь от АЦ — фермента, осуществляющего его синтез, да и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) — фермента, обеспечивающего его деградацию. Изучена динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мускул кур. Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Houslay, 1985). Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не меняется через 2.5 и 5.0 мин опосля деяния инсулина, возрастает на +115% через 10 мин и на +179% через 20 мин, по сопоставлению с базальной активностью фермента, принятой за 100% (Таблица 4).
Таблица 4. Воздействие инсулина (10-8М) на активность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мускул кур зависимо от времени
Действия
Активность цАМФ-ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка)
2.5 мин
5.0 мин
10.0 мин
20.0 мин
Без инсулина
3.37±0.5
(100%)
3.70±0.33
(100%)
3.56±0.61
(100%)
3.21±0.28
(100%)
+ инсулин
3.06±0.21
(91%)
4.07±0.18
(110%)
7.65±0.23
(215%)
8.95±0.44
(279%)
Примечание: в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в%) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100%
При исследовании деяния различных концентраций инсулина (10-9М-10-7М) найдено, что более выраженное действие гормона (+115%) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10-8М (данные в диссертации).
Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации деяния инсулина на клеточку является принципиальным моментом в осознании внутриклеточных устройств функционирования пептидов инсулиновой природы.
При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превосходить скорость его деградации. Увеличение уровня цАМФ приводит к активации мишени его деяния — ПКА. Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит поначалу насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и только потом гидролиз цАМФ с ролью ФДЭ.
Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ верно разбиты во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин. Меж тем, цАМФ-ФДЭ активизируется инсулином лишь через 10 минут инкубации с гормоном. Таковым образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает только тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и произведет свое активирующее действие на ПКА, а потом и на эффекторные системы (Ткачук, 1983), что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы.
В связи с сиим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного деяния пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы.
Использование антиинсулиновой сыворотки для подтверждения специфики АЦ стимулирующего эффекта инсулина
Для подтверждения АЦ стимулирующего действие инсулина, а не остальных пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была применена анти-инсулиновая сыворотка (АИС), выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ. При добавлении обычной сыворотки (без инсулина) к фракции скелетных мускул крыс и гладких мускул моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет +68% у крыс и +41% у моллюсков. При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+7%) и моллюсков (-5%) (Табл. 5).
Приобретенные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется конкретно инсулином и является специфическим при действии этого гормона.
Таблица 5. Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мускул крыс и гладких мускул моллюска в присутствии антиинсулиновой сыворотки
действия
Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
Обычная сыворотка
Анти-инсулиновая сыворотка
Гладкие мышь«>мускулы
крысы
Без инсулина
97.344.58 (100%)
115.826.49 (100%)
Инсулин 10-8М
163.496.17* (168%)
110.037.12 (95%)
Примечание: приведены данные из 3-х независящих тестов, повторенных трижды. значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны (р< 0.05
. В скобках — активность АЦ в %. Базальная активность принята за 100%.
Последующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего деяния инсулина и ИФР-1.
В данной нам части работы мы поэтапно изучили звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию деяния инсулиноподобных пептидов, начиная от сенсора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала.
Роль сенсора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства
Для подтверждения роли сенсора тирозинкиназного типа, соответствующего для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы, употребляли селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ — тирфостин 47 и генистеин, которые заблокируют тирозинкиназную функцию сенсора инсулина и остальных пептидов инсулиновой природы. Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15 мин опосля что в пробу добавляли пептиды (время деяния 2.5 мин) при концентрации, вызывающей наибольший АЦ стимулирующий эффект. Воздействие этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сопоставления на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных), которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через сенсор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков.
У крыс в присутствии тирфостина 47 (1.25-5.0 мкМ) активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50%, при ИФР-1 до 65%, при ЭФР до 50% по отношению к наибольшему эффекту пептидов, принятому за 100% (Рис. 10). В присутствии генистеина (1.25-5.0 мкМ) понижение АЦ стимулирующих эффектов всех применяемых пептидов у крыс было наиболее выражено. Эффект инсулина снижался до 40%, эффект ИФР-1 до 10%, эффект ЭФР — до 18% (рис. 11). В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (10-6М) фактически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ).
В культуре клеток 4-х дневных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис. 12) и генистеин (данные представлены в диссертации) ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43% и 38%, соответственно. Но, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось (р < 0.05). Это свидетельствует о том, что традиционные нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри серпантинного типа не участвуют в механизме деяния пептидов инсулиновой природы.
Рис. 10. По оси ординат — понижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии тирфостина 47
Рис. 11. По оси ординат — понижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии генистеина
Рис. 12. По оси ординат — понижение стимулирующего эффекта инсулина и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии тирфостина 47
Рис. 13. По оси ординат — понижение стимулирующего эффекта пептидов и серотонина на АЦ (принятого за 100%)
Рис. 14. По оси абсцисс — концентрация генистеина в мкМ; по оси ординат — понижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100%) в присутствии генистеина
У моллюсков более выраженное понижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2.5 мкМ). Эффект инсулина уменьшался до 20%, эффект ЭФР до 30-35%. (Рис. 13). В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25% в случае инсулина (1.25 мкМ генистеин), и до 50-75% в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис. 14).
нужно выделить, что у моллюсков A.cygnea активность АЦ возрастает не в присутствии изопротеренола, а в присутствии серотонина, реализующего свое действие также через сенсоры серпантинного типа (Pertseva et al., 1992). исследование деяния ингибиторов тирозинкиназ — тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило конфигураций в действии этого биогенного амина на активность АЦ.
Таковым образом, в мембранной фракции крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее воздействие исследуемых пептидов на АЦ понижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в спектре концентраций — 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис. 10-14).
Стимулирующее действие изопротеренола (крысы, куры) либо серотонина (моллюски) на АЦ, реализуемое через нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 либо генистеина в исследуемых объектах (см. Рис. 10-14).
Можно заключить, что в мышечной ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) млекопитающих (крысы), птиц (куры), культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с ролью рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для деяния этих пептидов. (Pertseva et al., 1996; Plesneva et al., 2003).
Роль G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина
Для подтверждения роли G-белков в действии инсулина на активность АЦ был использован обширно всераспространенный подход, в каком употребляется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени или провоцировать ГТФ-азную активность G-белков в присутствии ГТФ и его аналогов — ГТФ?S, ГИДФ и тем активировать АЦ, или ингибировать ГТФ-азную активность G-белка в присутствии ГДФ?S.
Было изучено воздействие ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл. 6).
Таблица 6. Воздействие гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска
действия
Звериные
Крыса
Моллюск
Активность АЦ (%)
Контроль
100±1.01%
100±1.3%
Инсулин (10-8М)
222±1.3%
(+122%)
186±1.8%
(+86%)
ГТФ?S (10-5М)
242±1.4%
(+142%)
470±9.4%
(+370%)
ГИДФ (10-5М)
236±1.8%
(+136%)
269±4.9%
(+169%)
ГТФ (10-5М)
135±1.05%
(+35%)
163±5.1%
(+63%)
ГДФ?S (10-5М)
95±1.2%
(-5%)
92±2.4%
(-8%)
Инсулин + ГТФ?S
473±2.5%
(+373%)
[109%]
726±20.3%
(+626%)
[170%]
Инсулин + ГИДФ
399±8.2%
(+299%)
[41%]
441±12.3%
(+341%)
[86%]
Инсулин + ГТФ
277±10.1%
(+177%)
[20%]
279±8.4%
(+179%)
[30%]
Инсулин + ГДФ?S
102±5.4%
(+2%)
[-17%]
105±4.3%
(+5%)
[-86%]
Примечание: в круглых скобках — активирующий АЦ эффект применяемых агентов в% по отношению к базальной активности, принятой за 100%. В квадратных скобках — потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %.
Согласно представленным данным, ГТФ?S, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сопоставлению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, работающих раздельно — в присутствии ГТФ?S, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на +170%, 86% и 30% у моллюсков (табл. 6). ГДФ?S же напротив понижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков.
Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФ?S, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФ?S свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм деяния пептидов инсулинового суперсемейства.
Таблица 7. Воздействие коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea
Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
действия
Скелетные мускулы крысы
Гладкие мускулы моллюска
Без КТ (Компьютерная томография — метод неразрушающего послойного исследования внутренней структуры объекта)
+КТ (Компьютерная томография — метод неразрушающего послойного исследования внутренней структуры объекта)
Без КТ (Компьютерная томография — метод неразрушающего послойного исследования внутренней структуры объекта)
+КТ (Компьютерная томография — метод неразрушающего послойного исследования внутренней структуры объекта)
Без пептидов
39.7±3.4
48.5±2.0
63.2±4.1
69.1±9,6
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
Инсулин
67.9±3.6
48.2±2.7
200.5±14.4
74.2±7.6
10-9М
(171%)
(99%)
(317%)
(108%)
ИФР-1
57.4±2.1
43.1±1.6
139.2±12.4
76.8±7.3
10-9М
(145%)
(89%)
(220%)
(111%)
Без ХТ
+ХТ
Без ХТ
+ХТ
Без пептидов
39.6±2.6
79.7±2.7
47.4±3.0
94.3±5.6
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
Инсулин
69.3±2.8
105.8±7.4
151.7±9.8
134.0±7.5
10-9М
(175%)
(133%)
(320%)
(142%)
ИФР-1
56.7±4.2
106.2±6.5
100.0±5.4
122.6±8.8
10-9М
(143%)
(133%)
(210%)
(130%)
Примечание: В скобках — активность АЦ в%. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.
Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм деяния инсулина и ИФР-1 были применены бактериальные токсины (Токсин др.-греч. (toxikos) — ядовитый — яд биологического происхождения) (коклюшный и холерный), которые видоизменят ?-субъединицы Gi и Gs белков.
Коклюшный токсин (яд биологического происхождения) вызывает АДФ-рибозилирование ?i-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его многофункциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Понятно, что ??-димер Gi белка владеет своей регуляторной способностью и может провоцировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсин (яд биологического происхождения), предотвращая индуцируемую инсулином либо ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через ??-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.
Воздействие холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности ?s-субъединицы и тем переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с сиим обработка мембран холерным изучающая характеристики ядовитых веществ звериного может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и вместе с сиим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным растительного и микробного происхождения»> растительного и микробного происхождения»>токсином (Токсинология — наука, изучающая свойства ядов животного, растительного и микробного происхождения) приводит к 2х-кратному повышению базальной активности АЦ и понижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что на сто процентов согласуются со сведениями литературы и показывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с ролью инсулина либо ИФР-1.
Таковым образом, совокупа данных, приобретенных с внедрением коклюшного и холерного токсинов, показывает на роль как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме деяния инсулина и ИФР-l.
Роль фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1
Для выяснения роли ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был применен специфичный ингибитор этого фермента — вортманнин. несколько понижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 ясно стимулируют активность АЦ. Меж тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 понижается зависимо от концентрации ингибитора (10-9-10-7М). Ингибирующее действие вортманнина было более выражено при концентрации 10-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют о участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме деяния инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.
Таблица 8. Воздействие вортманнина (10-9М-10-7М) на стимуляцию ИФР-1 (10-8М) и инсулином (10-8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мускул моллюска Anodonta cygnea
Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
объекты
Крысы
Моллюски
действия
без пептида
ИФР-l
инсулин
без пептида
ИФР-l
инсулин
без ворманнина
21±1.6
38.2±1.0*
41.4±2.3*
17.8±1.0
41.1±2.6*
24.5±1.0*
+вортманнин
10-9М
17.9±2.0
9.4±1.3
9.7±1.4
15.8±2.0
14.6±1.3
14.2±0.4
+вортманнин
10-8М
16.5±2.3
8.6±1.3
8.4±1.3
14.6±2.3
13.9±0.8
11.6±1.0
+вортманнин
10-7М
13.2±1.9
6.3±0.9
6.8±0.8
14.3±0.9
13.8±1.8
7.4±0.5
Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.
Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего деяния вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были применены изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через сенсор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов проявили отсутствие воздействия вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Данный факт показывает на роль ФИ-3-К в, найденным нами, АЦ сигнальном механизме деяния инсулина и ИФР-1.
Роль протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулинового суперсемейства
Для подтверждения роли ПКС в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулиновой природы употребляли селективный блокатор ПКС — кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как найдено нами, кальфостин (10-10-10-8М) перекрыл АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мускул крысы и моллюска. Более выраженный ингибирующий эффект кальфостина находится при концентрации 10-8М. В присутствии кальфостина (10-8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к наибольшему АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации).
Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме деяния пептидов инсулиновой природы употребляли моноклональные антитела к ПКС?, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.
Таблица 9. Воздействие антитела к ПКС? практически на сто процентов блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9). Таковым образом, внедрение моноклональных действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Меж тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего деяния на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека) позвоночных.
Таковым образом, истинное исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неведомого АЦ сигнального механизма деяния инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных звериных. Этот механизм имеет принципно схожую структурно-функциональную компанию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он быть может представлен в клеточке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника — цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к разным эффекторным системам.
В плане исследования многофункциональной роли, найденного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было изучено его роль в реализации регуляторного деяния пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.
Роль АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы
Для исследования митогенного деяния пептидов инсулинового суперсемейства мы употребляли фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, разлюбезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии ран (Санкт-Петербург). Проведена многофункциональная черта АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток
]]>