(5 оценок, среднее: 4,80 из 5)
Загрузка...
Учебная работа. Анализ изменений осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры
анализ конфигураций
осмотических параметров эритроцитов
при изменении температуры
КУРСОВАЯ РАБОТА
Содержание
Список сокращений
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Значимость определения осмотической резистентности эритроцитов в диагностике болезней
1.2 характеристики эритроцитов, обусловливающие их осмотическую резистентность, и изменение их при окислительном психологии выделяют положительную эустресс и отрицательную дистресс формы стресса»> психологии выделяют положительную эустресс и отрицательную дистресс формы стресса»>стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса).
1.3 температура как один из принципиальных причин, влияющий на осмотические характеристики эритроцитов, растворимость газов, сродство гемоглобина к кислороду
2 Материалы и способы
2.1 Хим вещества и буферы
2.2 Выделение эритроцитарной массы
2.3 Обработка эритроцитарной массы пероксиазотистой кислотой
2.4 способ осмотического гемолиза
2.5 Способы обработки экспериментальных данных
2.6 Применяемые компьютерные программки (Origin,Mathcad)
3 Основная часть
3.1 Осмотические характеристики эритроцитов в интервале температур 5-37?С
3.2 Осмотические характеристики эритроцитов в интервале температуре 50?С
3.3 Сравнительный анализ конфигурации осмотических параметров эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса)
4 Заключение
5 Перечень использованных источников
Список сокращений
Н2О2 -пероксид водорода
О2.- -супероксид анион радикал
ОН — гидроскил радикал
.NO -монооксид азота
ONOO- -пероксинитрит-анион
HOONO — пероксиазотистая кислота
NaNO2 — нитрит натрия
NaH2PO4 — дигидро фосфат натрия
Na2HPO4 — гидрофосфат натрия
ПОЛ — перекисное окисление липидов
NO3- — нитрат
HNO2 — азотистая кислота
Hb — гемологбин
Введение
Актуальность темы: Температура является фактором наружной среды, оказывающим большущее воздействие на проходящие в организме физико-химические процессы. температура тела является физиологической чертой организма, отражающая состояние его термического баланса. Конфигурации обычной температуры тела наблюдаются при разных заболеваниях вследствие расстройств устройств теплорегуляции. При большинстве воспалительных болезней температуры тела увеличивается. Снижение температуры тела ниже 36С — гипотермия — может наблюдаться при отравлении никотином, алкоголем, эфиром, при уремической и диабетической коме, томных истощающих заболеваниях [1]. температура является регулятором функций белков, в том числе, ферментов, структурных и транспортных белков. В крайние десятилетия были выявлены новейшие механизмы транспорта ионов и молекул через клеточные мембраны, открыты новейшие транспортеры, к примеру, транспортеры воды — аквопорины [10]. Нобелевская премия по химии за 2003 год была присуждена ученым П. Эгру и Р Мак-Киннону за исследование аква и ионных каналов. Функции белков также меняются и при хим модификации их структур, к примеру, в итоге их реакций с активными формами кислорода и азота. Завышенная генерация активных форм азота и кислорода в клеточке приводит к парадоксу, нареченному окислительным гомеостаз) от англ. stress — давление и наблюдаемому при разных заболеваниях [11]. неувязка действия на человеческий организм активных форм азота в истинное время является животрепещущей. Уровень поступления NOx-соединений в организм человека в связи с расширением областей их использования и с повышением степени загрязнения окружающей среды повсевременно возрастает (с питьевой водой, едой, лекарствами, вдыхаемым воздухом). Исследование воздействие температуры и активных форм кислорода и азота на клеточные процессы в свете новейших представлений дозволяет осознать молекулярно-клеточные базы болезней человека и отыскать новейшие пути корректировки патологических состояний человека.
Цель работы: Выявить механизмы конфигурации характеристик осмотического гемолиза при изменении температуры и при окислительном стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса) эритроцитов.
Задачки:
1. Провести анализ литературных данных о температурных зависимостях разных параметров эритроцитов.
2. Выявить и проанализировать конфигурации осмотических параметров эритроцитов в интервале температур 5-37С.
3. Выявить и проанализировать изменение осмотических параметров эритроцитов при 50°С.
4. Провести сравнительный анализ конфигурации осмотических параметров эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса).
Практическая значимость: исследование деяния температуры на транспортные процессы в клеточке дозволит выявить молекулярные механизмы физиологических и патологических действий, как же создать способы их восстановления на молекулярном уровне.
1. Обзор литературы
1.1 Значимость определения осмотической резистентности эритроцитов в диагностике болезней
Омотическая резистентность эритроцитов имеет огромное клинико-диагностическое конфигурации при тиреотоксикозе, бронхопневмонии, туберкулезе, малярии, лейкемии, миелосклерозе, лимфогранулематозе, циррозе печени и остальных.[3-5] Наследный микросфероцитоз был в первый раз описан в 1900 году Минковским, а в предстоящем наиболее тщательно — Шоффаром. В базе воды, вследствие чего же образуются сферические эритроциты (сфероциты). Сфероциты, в отличие от обычных двояковогнутых эритроцитов, не владеют способностью деформироваться в узеньких участках кровотока (тока внутренней среды организма), к примеру при переходе в синусы селезенки. Это ведет к замедлению продвижения эритроцитов в синусах селезенки, отщеплению части поверхности эритроцита с образованием микросфероцитов (отсюда заглавие работоспособности»>заболевания — микросфероцитоз) и постепенной их смерти. Разрушенные эритроциты поглощаются макрофагами селезенки. Неизменный гемолиз эритроцитов в селезенке ведет к гиперплазии клеток ее пульпы и повышению органа. В связи с усиленным распадом эритроцитов в сыворотке увеличивается содержание вольного билирубина. Поступающий в завышенном количестве в кишечный тракт билирубин выводится из организма с мочой и основным образом с калом в виде стеркобилина. Суточное выделение стеркобилина при наследном микросфероцитозе превосходит норму в 10 20 раз. Следствием завышенного выделения билирубина в желчь является плейохромин желчи и образование пигментных камешков в желчном пузыре и протоках. Клиника зависит от выраженности гемолиза. Почти всегда 1-ые признаки выявляются в юношеском либо зрелом возрасте. У малышей болезнь находится обычно при обследовании по поводу работоспособности»>заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности) могут отсутствовать. В период обострения отмечаются слабость, головокружение (Головокружение — ощущение неуверенности в определении своего положения в пространстве), увеличение температуры. Одним из главных клинических симптомов является желтуха, которая длительное время может оставаться единственным признаком заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности).
Анемия при наследном микросфероцитозе носит нормохромный нрав. В мазке крови (внутренней средой организма человека и животных) преобладают микросфероциты, отличающиеся отсутствием соответствующего для обычных эритроцитов центрального просветления. Доминирование микроцитов выявляется графически на кривой Прайс-Джонса, отражающей количественные соотношения эритроцитов разных поперечников (средний поперечник обычного эритроцита составляет 7 — 7,5 мкм). При наследном микросфероцитозе верхушка кривой Прайс-Джонса растянута и сдвинута на лево в сторону микроцитов. Количество ретикулоцитов увеличено. Число лейкоцитов обычно нормально. При гемолитических кризах отмечается нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом на лево. количество тромбоцитов варьирует в границах нормы. В костном системы животных, обычно расположенный в головном отделе тела и представляющий собой компактное скопление нервных клеток и их отростков) — центральный отдел нервной системы человека и звериных отмечается выраженная гиперплазия эритроидного ростка. Содержание непрямого билирубина в крови (внутренней средой организма человека и животных) повышено равномерно и, обычно, не превосходит 50 — 70 мкмоль/л. Определяется завышенное содержание уробилина в моче и стеркобилина в кале. диагноз (медицинское заключение об имеющемся заболевании) наследного микросфероцитоза ставится на основании течения ткани) в правом подреберье, анемия), данных исследования периферической крови (внутренней средой организма человека и животных) (нормохромная анемия, ретикулоцитоз, микросфероцитоз).
Принципиальное признаки гемолиза либо микросфероцитоз без клинических проявлений. Доп диагностическими аспектами может служить ряд лабораторных тестов. Соответствующим лабораторным признаком крови (внутренней средой организма человека и животных) эритроцитов сферической формы — сфероцитов, которые, наименее стойки к осмотическому гемолизу, чем обычные макропланоциты. Эритроциты нездоровых наследным микросфероцитозом просто разрушаются опосля дневной инкубации дефибринированной крови (внутренней средой организма человека и животных) в термостате при 37° С. Добавление к эритроцитам глюкозы существенно уменьшает гемолиз, в то время как АТФ не влияет на него. [6]
Осмотическая резистентность эритроцитов является одним из характеристик в способе оценки отека-набухания головного мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека). Отек (избыточное накопление жидкости в органах)-набухание мозга (ОНГМ) — патологический процесс, возникающий при почти всех неблагоприятных действиях и проявляющийся морфофункциональными переменами во всех органах и системах организма с преимущественным поражением ЦНС (центральная нервная система, головной работоспособности»>заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности) при самой различной патологии. Так, послеоперационный ОНГМ у нейрохирургических нездоровых отмечается в 95% случаев.
Действенная медикаментозная профилактика и оздоровление»>вопросец о способах, при помощи которых оценивается эффективность проводимого исцеления. Применяемые сейчас в практической медицине клинические и лабораторные характеристики, свидетельствующие о наличие ОНГМ, соединены в главном с исследованием головного и спинного мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека), мозгового кровообращения (Кровообращение — важный фактор в жизнедеятельности организма человека и ряда животных) и ликвора. Возникновение компьютерной томографии (Томография др.-греч. — сечение — получение послойного изображения внутренней структуры объекта), магнитно-резонансной томографии (Томография др.-греч. — сечение — получение послойного изображения внутренней структуры объекта), раздельной импедансометрии существенно расширило способности диагностики ОНГМ. Но, невзирая на все успехи, достигнутые на этом пути, внедрение в практической медицине обозначенных способов с целью диагностики ОНГМ очень проблемно. Почти все из их требуют сложной аппаратуры и не постоянно доступны.
Не так давно был предложен новейший способ исследования динамики ОНГМ и эффективности его фармакотерапии. способ основан на исследовании водно-электролитного баланса компонент крови (внутренней средой организма человека и животных).
В опыте на крысах были изучены содержание фракций воды, ионов натрия и калия в эритроцитах и плазме крови (внутренней средой организма человека и животных), углеводно-энергетический метаболизм и осмотическая резистентность эритроцитов, гематокритная величина и некие характеристики свертывающей системы крови (внутренней средой организма человека и животных) при ОНГМ и при его фармакотерапии. Выявлен ряд характеристик (содержание связанной и вольной воды, натрий/калиевый коэффициент, средняя клеточная хрупкость, уровень лактата), изменение которых в эритроцитах и плазме крови (внутренней средой организма человека и животных) тесновато соединены с переменами содержания общей воды и плотности мозговой ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология). Совокупа конфигураций гематологических характеристик и степень их выраженности легли в базу разработанного метода оценки динамики ОНГМ.
Этот способ отдал возможность учить динамику ОНГМ (прогрессирующее, непрогрессирующее течение, оборотное развитие), оценивать эффективность проводимой фармакотерапии, составлять прогноз течения процесса. Этот способ доступен хоть какой медицинской лаборатории, не просит дорогостоящей аппаратуры, просто выполним. [7]
Также выявлено изменение осмотической резитентности при остальных заболеваниях нервной системы, к примеру, детский церебральный паралич (полное отсутствие произвольных движений). Это работоспособности не моделируется на звериных и не воспроизводится в культуре клеток. создателей было предложено употреблять клеточки крови (внутренней средой организма человека и животных) — эритроциты для исследования действий, происходящих в организме в целом.
Было показано, что черта ионного транспорта в эритроцитах и нервных (орган животного, служащий для передачи в время заболевания в ЦНС (центральная нервная система, головной конфигурации. В опыте активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ЦНС (центральная нервная система, головной крови (внутренней средой организма человека и животных). У нездоровых со всеми формами цереброваскулярных болезней отмечено понижение деформируемости эритроцитов. Изменение пластичности мембран эритроцитов отражает общее повреждение биомембран организма [8].
Таковым образом, динамика конфигурации осмотической резистентности под воздействием разных причин дозволяет судить не только лишь о конфигурациях в эритроцитах, да и о конфигурациях в остальных органах и тканях. Большая роль в регуляции трансмембранного транспорта ионов, модификации активности интегральных и периферических белков мембраны отводится изменениям фосфолипидного состава мембран эритроцитов. Общность строения плазматических мембран разных органов и тканей дозволяет мыслить, что процессы, происходящие в эритроцитарной мембране, отражают конфигурации в мембранах остальных органов и тканей [8]
1.2 Характеристики эритроцитов, обусловливающие их осмотическую резистентность, и изменение их при окислительном физиологии (Физиология от греч. — природа и греч. — знание — наука о сущности живого)
Осмотические характеристики эритроцитов обоснованы мембранным транспортом через эритроцитарную мембрану. Транспорт веществ (воды, ионов) осуществляется через аквопорины и ионные каналы, и зависит от особенностей эритроцита и экзогенных причин (присутствие окислителей, температура и остальных).
Эритроцит — высокоспециализированная клеточка, транспортирующая кислород [9]. У человека и млекопитающих эритроциты не содержат ядра. Отсутствие ядра обеспечивает то, что эритроциты потребляют на собственные нужды кислорода в 200 раз меньше, чем ядерные представители (эритробласты, нормобласты).
размеры эритроцита: поперечник -7.7 мкм, толшина-2.2 мкм. Размер эритроцита-76-96 фемтолитров (фетмо-1 биллиардная).
одной из принципиальных особенностей эритроцита является их форма двояковогнутых дисков. Двояковогнутая форма эритроцитов:
-увеличивает на 20% общую поверхность по сопоставлению с формой шара. Общая поверхность всех эритроцитов добивается 3800 м2, что в 1500 раз превосходит поверхность тела.
-способствует выполнению их одной из главных функций — переносу кислорода и углекислого газа, т.к. диффузионная поверхность возрастает, а диффузионное расстояние миниатюризируется.
-увеличивает способность к обратимой деформации (пластичность )при прохождении через узенькие и изогнутые капилляры. Пластичность эритроцитов понижается по мере их старения и зависит от их формы. Так, эритроциты, имеющие патологически модифицированную их форму (сфероциты, серповидные), владеют наименьшей пластичностью.
В структуре эритроцита различают остов клеточки — строму и поверхностный слой — мембрану. Толщина мембраны равна 10нм. Мембрана эритроцита состоит из 4 слоев:
-наружный — образован гликопротеидами.
-средние 2 слоя — двойной липидный слой.
-внутренний — белки.
Мембрана эритроцита владеет свойством избирательной проницаемости:
-пропускает газы, Н2О, Н+, спирт.
-малопроницаема для глюкозы, мочевины, ионов.
-почти не проходит через нее большая часть катионов.
-совершенно не проницаема для белков.
Хим состав эритроцита: 60%-Н2О, 40%-сухой остаток (практически 90% его приходится на долю гемоглобина). Остальное — это липиды, углеводы, соли.
Функции эритроцитов:
-перенос кислорода гемоглобином
-перенос углекислого газа (с ролью гемоглобина, карбоангидразы, ионообменника Cl-/HCO3).
-защитная (адсорбция вредных веществ, перенос на поверхностях иммуноглобулинов, компонент системы комплемента, иммунных комплексов, выделяют антибиотик эритрин).
-регуляция аква и солевого обмена.
-перенос питательных веществ (адсорбция и перенос аминокислот).
-креаторная, состоит в переносе макромолекул, осуществляющих в организме информационные связи.
-участвует в регуляции кислотно-основного состояния (гемоглобиновый буфер).
-участие в свертывании крови (внутренней средой организма человека и животных) (содержат тромбопластин, освобождающийся при их разрушении; возникновение в крови (внутренней средой организма человека и животных) разрушенных эритроцитов содействует гиперкоагуляции и тромбообразованию; вкупе с тем, они являются носителями гепарина, являющегося антикоагулянтом).
В 1990 году в институте медицинской иммунологии Сибирского отделения АН СССР (Союз Советских Социалистических Республик, также Советский Союз — организм, и влияя, таковым образом, на содержание эритроцитов, представляется вероятным действовать на иммунологическую реактивность, что расширяет возможность борьбы с лейкозами, злокачественными опухолями и аутоиммунными болезнями.
-участвуют в регуляции эритропоэза. При разрушении эритроцитов освобождаются находящиеся в их эритропоэтические причины, оказывающие стимулирующее воздействие на образование эритроцитов в костном расположенный в головном отделе тела«>мозге (Мозг — центральный отдел нервной системы человека и животных, расположенный в головном отделе тела).
Итак, некие принципиальные свойства эритроцита:
1. способность деформироваться,
2. отсутствие ядра,
3. отсутствие рибосом,
4. отсутствие митохондрий,
5. переносит О2 гемоглобином.
структура био мембран лабильна, т.е. под действием ряда причин, в том числе и таковых, которые не приводят к потере нативных параметров мембраны, способны вызывать в ней структурные кооперативные переходы. Энтузиазм к таковым переходам стимулировался выдвинутым предположением о структурно-мембраном механизме регуляции актуальных действий в клеточке.
Ученые еще посреди XIX века высказывали догадки о том, что в клеточной оболочке есть поры для просачивания воды, но долгое время преобладало мировоззрение, что вода просто диффундирует через клеточную мембрану.
В конце 1950-х годов было установлено, что в мембранах эритроцитов есть особые каналы, через которые вода проходит, а ионы — нет. При всем этом клеточный «водопровод» владеет потрясающей пропускной способностью: до млрд молекул воды за секунду. Разумно было представить, что, как и в случае остальных веществ, к примеру сахаров и аминокислот, транспорт воды через мембрану происходит при помощи белка. Но какой конкретно белок делает данную функцию? Этот вопросец достаточно длительно оставался без ответа.
Открытие аквопорина — белка, образующего водную пору, — вышло благодаря счастливой случайности. В 1987 году Питер Эгр, изучая белки-антигены эритроцитов, нашел мембранный белок с неизвестнойфункцией. Оказалось, что таковой же белок в обилии находится в почечных канальцах — тканях, которые способны прокачивать большие количеств воды. Это и навело ученого на идея, что отысканный белок имеет отношение к транспорту воды через клеточную мембрану. П. Эгр и его коллеги смогли установить аминокислотную последовательность белка и потом клонировали участок ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов), кодирующий синтез аквопорина.
Ученые провели несколько тестов, безоговорочно доказывающих главную роль этого белка в транспорте воды. К примеру, если «вынудить» клеточку создавать аквапорин в огромных количествах, она начинает активно всасывать воду, набухает и практически разрывается от лишнего внутреннего давления.[10]
Пространственная структура аквапорина припоминает цилиндрический канал, по которому движутся молекулы воды. Через него проходит лишь вода, но не ионы. Аминокислоты в белке размещены таковым образом, что полярность создаваемого ими электростатического поля «переключается» в центре молекулы на оборотную. Потому молекулы воды, дойдя до середины канала, переворачиваются так, что их дипольные моменты в верхней и нижней части канала ориентированы в обратные стороны. Такое переориентирование предутверждает просачивание через канал ионов. Аквапорин не пропускает даже ионы гидроксония Н3О+ (другими словами гидратированные протоны), от концентрации которых зависит кислотность среды.
Открытый П. Эгром белок — 1-ый, но не единственный из семейства аквапоринов, К истинному времени понятно около 200 разновидностей белков аква каналов у растений и звериных, в том числе и у человека. Благодаря аквапоринам клеточки не только лишь регулируют собственный размер и внутреннее давление, да и делают такие принципиальные функции, как всасывание воды в почках звериных и корешках растений.
Создав белковые поры, пропускающие через клеточную мембрану чистую воду, природа позаботилась и о том, чтоб обеспечить каналы для переноса компонент растворенных в воде солей, до этого всего ионов натрия и калия. Транспорт этих заряженных частиц дозволяет клеточке генерировать и передавать электронные сигналы.
Еще в 1890 году Вильгельм Оствальд, нобелевский лауреат 1909 года, показал, что электронные токи в {живых} тканях могут быть вызваны ионами, которые передвигаются через клеточную мембрану. Главные принципы работы ионных каналов и роль ионов в работе нервной системы установлены в 1950— 1960-е годы. В 1963 году за открытия в данной области английским исследователям Алану Ходжкину и Эндрта Хаксли присудили Нобелевскую премию, но молекулярные механизмы ионного транспорта оставались неясными до крайнего времени.
Ученых в особенности заинтересовывало устройство канала, который пропускал ионы калия, но почему-либо не давал пройти чуток наименьшим по размеру ионам натрия. Высказывалось предположение, что белок, образующий канал, содержит фильтр из нескольких атомов кислорода, которые имитируют оболочку из молекул воды, окружающую ион калия в обычном состоянии. Чтоб внести в этот вопросец окончательную ясность, требовались данные рентгеноструктурного анализа, но получить их оказалось не попросту — для этого требовалось вырастить из белка кристалл. Первым, кто смог достигнуть результата, стал Родерик Мак-Киннон. В 1998 году он представил трехмерную структуру калиевого ионного канала бактериальной мембраны. Это позволило изучить работу ионного фильтра во всех деталях. Оказалось, что расстояния меж атомами кислорода и ионом калия снутри канала в точности соответствуют расстояниям меж калием и кислородом воды в растворе. Конкретно потому калий беспрепятственно проходит через канал, а натрий остается в аква растворе.
Исследование мембранных каналов, как аква, так и ионных, имеет не только лишь теоретическое
В центре аква канала, образованного белком аквапорином, сосредоточен положительный, заряд. Потому положительно заряженные ионы, к примеру ион гидроксония, через канал пройти не могут.
Рис.1 Схема аквопорина
Этот ионный канал пропускает ионы калия, но не натрия. Вне клеточной мембраны (А) ионы калия и натрия находятся в окружении молекул воды (показаны на рисунке красноватым цветом). Снутри фильтра (В) атомы кислорода образуют структуру, которая имитирует водную оболочку иона калия. Наименьший по размеру ион натрия не соответствует структуре фильтра и не может пройти через канал.
Рис.2. Тетрамерная структура аква канала
Окислительный системы окисления превалируют над системами восстановления, инициируя ПОЛ, окисление белков, углеводов, нуклеиновых кислот, в конечном счете, ведя к погибели клеточки в итоге мощного окислительного стресса. Умеренный, приобретенный окислительный физическое либо психологическое может изменять системы восстановления клеточки, увеличивая либо понижая активность ферментов, включенных в эти системы, и исчерпывая клеточные резервы антиокислительных соединений типа глутатиона и витамина (витамины — сборная по химической природе группа органических веществ, объединённая по признаку абсолютной необходимости их для гетеротрофного организма в качестве составной части пищи) E.[11]
Окислительный нарушающее его гомеостаз»> нарушающее его гомеостаз»>стресс
(неспецифическая (общая) реакция организма на воздействие (физическое или психологическое), нарушающее его гомеостаз) — признак обычной аэробной жизни эритроцита, которая, но, сбалансирована сильными ферментативными и неферментативными антиокислительными системами защиты (другими словами каротиноидами, витаминами E и C, флавонидами, GSH-пероксидазой, супероксид дисмутазой, каталазой) .
Развитие почти всех заболеваний человека соединено с образованием активных форм азота, которые могут вызывать окислительный нарушающее его гомеостаз«>стресс (неспецифическая (общая) реакция организма на воздействие (физическое или психологическое), нарушающее его гомеостаз) клеточки.[17]
Расположено на /
Расположено на /
Рис.3 Схема образования активных форм азота
Осмотические характеристики эритроцитов при окислительном кислоты происходит изменение формы кривой гемолиза. С повышением концентрации пероксиазотистой кислоты возрастает ширина области гемолиза и кривая двигается к области изотонических концентраций (табл.1)[19].
Таблица 1. Изменение черт кривой осмотического гемолиза в Na-фосфатном буфере и в растворе NaCl при окислительном психологии выделяют положительную эустресс и отрицательную дистресс формы стресса»> физиологии (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса), вызванном пероксиазотистой кислотой
Концентрация реагентов, мМ
Na-фосфатный буфер
NaCl раствор
b50%, мОсм
b мОсм
b50%, %
b, %
0
130.99.9
42.79.7
0.6000.001
0.0070.001
1
141.97.1
35.96.7
0.604 0.026
0.0270.005
10
151.514.2
35.112.7
0.618 0.005
0.0210.001
1.3 температура как один из принципиальных причин, влияющий на: осмотические характеристики эритроцитов, растворимость газов, сродство гемоглобина к кислороду
температура является неотъемлемым фактором наружной среды, повсевременно работающим на клеточные мембраны и оказывающим большущее воздействие на проходящие в их физико-химические процессы.
температура тела — одна из важных черт обычного функционирования организма. В организме человека условно выделяют две температурные зоны — оболочку и ядро. Оболочку составляют поверхностно расположенные структуры (кожа и подкожная клетчатка), ядро- образованная водянистой соединительной тканью (Совокупность различных и взаимодействующих тканей образуют органы). Состоит из плазмы и форменных частей: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов»>тканью. Состоит из плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов), внутренние органы. температура оболочки ниже температуры ядра и не схожа в различных участках тела, что соединено с различием их кровоснабжения, шириной подкожной клетчатки и т.д. А именно самая высочайшая температура кожи в подмышечной ямке (т.н. аксилярная температура), самая низкая — кистей и стоп (24-28С при комнатной температуре).температура внутренних органов зависит от интенсивности протекающих в их окислительно-восстановительных действий, более высочайшая температура в печени (39С), несколько ниже температура желудка, почек и остальных органов.[1]
Рядовая физиологическая деятельность сопровождается колебаниями их температуры в границах толикой градуса. Во время интенсивной мышечной работы температура тела увеличивается на 1-2С, а сокращающихся мускул практически на 7С. температура кожи зависит от температуры окружающего воздуха, его влажности, скорости движения, нрава одежки, чистоты и влажности самой кожи и т.д. При очень неблагоприятных наружных критериях возникает остывание организма либо перегревание. Известны физиологические колебания температуры в течение денька: разница меж утренней и вечерней температурой тела обычно не превосходит 0,6С. В старом и старческом возрасте температура тала быть может несколько ниже, чем у людей среднего возраста. У здорового человека может наблюдаться неизменное увеличение либо снижение температуры тела (примерно на 0,5С по отношению к средней), также так именуемая многофункциональная асимметрия температуры тела, при которой отмечается разная температура в правой и левой подмышечных областях.
Исследование зависимости структурного состояния био мембран от температуры в значимой мере стимулировалось тем фактом, что почти все клеточные функции, конкретно либо опосредованно связанные с мембранами, проявляют аномалии в температурных зависимостях. анализ экспериментальных данных указывает, что более возможной предпосылкой этих аномалий являются структурные конфигурации в белковом и липидном компонентах мембранных систем, при этом если переход возникает в белках, то обычно на кривых Арениуса регистрируются изломы, если же в липидах то могут наблюдаються как изломы, так и разрывы.[4]
Одними из первых структурные конфигурации в био мембранах под действием температуры нашли Бенедетти и Эммелот: судя по электроно-микроскопическим даным, мембраны печени крысы при 2 и 37?С владели различной надмолекулярной организацией.
В особенности отлично к истинному времени термотропные переходы исследованы в мембранах микробов. Способом калориметрии внушительно показано, что при умеренных температурах (до 40С) конфигурации этих мембран обоснованы плавлением липидов, в то время как при наиболее больших температурах — денатурацией белков. Липидные переходы в бактериальных мембранах выражены довольно очень, что разъясняется отсутствием в их содержащийся в клеточных мембранах всех живых организмов за исключением безъядерных»>холестерин (органическое соединение, природный жирный, липофильный спирт, содержащийся в клеточных мембранах всех живых организмов за исключением безъядерных), термотропные переходы, происходящие в липидах, наименее выражены, и на их фоне при умеренных температурах могут появляться также белковые переходы.
Эритроцитарные мембраны выделяются посреди остальных высочайшим содержанием способами, но, проявили, что структура эритроцитарных мембран очень чувствительна к температурному действию. количество термотропных переходов, зарегистрированных к истинному времени как по структурным, так и по многофункциональным показателям, так велико, что для определенных температурных интервалов остается неясным. Охарактеризовывают конфигурации этих характеристик один широкий переход либо ряд разных восококоооперативных переходов.
Область температур ниже 25С.
Приведенные бессчетные данные свидетельствуют о том, что в области 17—20°С в эритроцитарной мембране происходит переход, который проявляется в изменении состояния белкового компонента. Результаты, приобретенные при исследовании остальных мембран, демонстрируют, что почаще всего конфигурации в мембранных белках при умеренных температурах происходят вследствие структурных переходов в окружающих их липидах. Подтверждением того, что структурный переход мембраны инициируется в липидной фазе, обычно является обнаружение конфигураций при данных температурах в выделенных из мембран липидах.
Таковым образом, совокупа экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что структурный переход эритроцитарных мембран при 17—20°С инициируется в бесхолестериновых липидных областях. Так как при всем этом затрагивается целый ряд функций, связанных с белками, то такие области, быстрее всего, содержат в себе пограничные липиды полифункциональных белковых систем, по-видимому, внутримембранных частиц.
Область температур 25-46С
В этих областях наблюдаются структурные перестройки эритроцитарной мембраны, индуцируемые в ее липидной фазе. При температуре гемолиза в эритроцитарной мембране есть области фазоразделенных липидов, по границам которых образуются «гемолитические» щели. действие температуры обосновано плавлением липидов в разных областях эритроцитарной мембраны. В эритроцитарной мембране в физиологической области температур наблюдаются два температурно-индуцикованных структурных перехода (при 28-36 и 42-46°С). Может быть также, что в данной области температур могут происходить переходы, инициируемые в белковых компонентах мембраны.
В области температур выше 46С в мембранах происходят переходы, имеющие необратимый нрав, что соединено с потерей ряда многофункциональных параметров клеток. Структурные перестройки в мембранах эритроцитов при завышенных температурах сопровождаются конфигурацией формы и деформируемости эритроцитов. При нагревании клеток от 43 до 54С наблюдается образование сфероцитов; а в области температур от 55 до 77С на их поверхности образуются зазубренности, и происходит разрушение эритроцитов.
Деформируемость эритроцитов, измеренная по их фильтруемости опосля инкубации клеток в течение 20 минут при завышенных температурах, начинает равномерно уменьшаться при 45с и резко исчезает в области 49-50с. Эта полная утрата деформируемости соответствует переходу диск-сфера, наблюдаемому под микроскопом. Переход, наблюдаемый в мембране при 42-50С, обоснован конфигурацией структуры входящего в ее состав спектрина. Также понятно, что термоустойчивость спектрина в изолированных мембранах и в целых эритроцитах различна: переход, обусловленный денатурационными переменами спектрина, происходит в изолированной мембране в области 46с, в то время как в эритроцитах в области 50С. Совпадение же температур, при которых нарушается структура спектрина в составе целых эритроцитов и наблюдаются морфологические конфигурации клеток, дает основание считать, что меж этими действиями существует причинно-следственная связь, при этом зачинателем структурных перестроек в мембране является спектрин.
Беря во внимание основную функцию эритроцитов — перенос газов, необходимо подчеркнуть воздействие температуры на растворимость кислорода и на сродство гемоглобина к кислороду.
Понятно, что растворимость газов в воде миниатюризируется с увеличением температуры. Так, в воде, насыщенной воздухом при 38с, 30с и 20С количество растворенного кислорода равно: 6.8, 7.36, 9.17мг/л. При всем этом парциальное давление кислорода составляет 148, 152 и 155 мм.рт.ст., т.е. в данном спектре концентрация кислорода меняется на 35% при практически постоянном его давлении.
Величены коэффициента диффузии кислорода при конфигурациях температуры могут вопить вычислены исходя из измемнений вязкости воды по законы Стокса- Энштейна
где: Т — температура (абсолютная); — вязкость воды в Пуазах.
Рис. 4 Зависимость содержания кислорода в воде и коэффициента диффузии от температуры
Сродство гемоглобина к кислороду также является фактором, зависящим от температуры
Глава 2. Материалы и способы
2.1 Хим вещества. Буферные смеси
В работе употребляли NaNO2, NaH2PO4, Na2HPO4, (“Реахим”, Наша родина, ч.д.а.). Другие реактивы (х. ч.) были производства Рф и Беларуси. Смеси NaNO2 и H2O2 готовили конкретно перед опытом.
2.2 Выделение эритроцитарной массы
Эритроцитарную массу получали из банка Гомельской областной станции переливания крови (внутренней средой организма человека и животных). Эритроциты три раза отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Гематокрит суспензий — 20-40 %.
2.3 Обработка эритроцитарной массы пероксиазотистой кислотой
Пероксиазотистую кислоту получали в реакции NaNO2 с H2O2 при эквимолярных концентрациях (0.025 мMоль — 10 мMоль) конкретно в закисленных суспензиях эритроцитов (pH 6.3) [16].
2.4 способ осмотического гемолиза
Мембраны клеточки — полупроницаемые барьеры, и имеют осмотические градиенты, установленные меж внутриклеточными и внеклеточными жидкостями, которые могут вынудить воду течь в и из клеточки. Величина осмотического давления зависит от разности концентраций ионов на каждой стороне мембраны. Внутриклеточная среда эритроцитов содержит соли, глюкозу, белки и гемоглобин. 0.9 % аква раствор NaCl является изотоническим. Когда клеточки крови (внутренней средой организма человека и животных) находятся в таковой среде, внутриклеточные и внеклеточные концентрации веществ находятся в осмотическом равновесии, и нет никакого притока либо оттока воды.
Способ осмотического гемолиза, основан на том, что осмотическая хрупкость (либо восприимчивость к гемолизу) эритроцитов не однородна, и число клеток, которые гемолизируются зависит от степени гипотоничности внеклеточной среды [14,17].
Оценка степени гемолиза эритроцитов в гипотонических смесях проводилась турбидиметрическим способом на длине волны 680 нм. Турбидиметрией именуют способ, основанный на изменении интенсивности светового потока, прошедшего через рассеивающую среду (к примеру суспензию клеток). В общем случае, интенсивность прошедшего светового потока зависит от светорассеяния и светопоглощения. При турбидиметрических исследовательских работах поглощение по способности исключают подходящим выбором длины волны падающего света. Турбидиметрия суспензий базирована на использовании неких закономерностей рассеяния света. С позиции теории светорассеяния звериные клеточки относятся к большим частичкам (дифракционный параметр больше 10). В области довольно малых концентраций рассеивающих частиц коэффициент турбодиметрического ослабления r прямо пропорционален числу частиц N .
r= a.N
Физический смысл коэффициента пропорциональности (а — сечение ослабления) — коэффициент ослабления одиночной частички,
а=К(s).3.14.R2
где, К(s)-коэффициент светорассеяния, являющийся сложной функцией относительного показателя преломления, размеров и формы частички, длины волны падающего света. Таковым образом, в базе турбдиметрии клеточных суспензий лежит уравнение:
r=K(s).3.14.R2.N,
позволяющее определять фотометрически концентрацию частиц в суспензии, относительные конфигурации концентрации, а, в ряде всевозможных случаев и остальные характеристики клеток усредненный радиус, конфигурации формы и т.п.
100% гемолизу соответствует оптическая плотность гемолизата в дистиллированной воде. 0% гемолизу соответствует оптическая плотность суспензии эритроцитов в изотоническом растворе. Данный способ комфортен при исследовании осмотического лизиса эритроцитов с окисленным гемоглобином.
методика исследования:
1. Взять семь пробирок по 4,0 мл с процентным содержанием NaCl: 0,9%,0,6%,0,56%,0,545%,0,53%, 0,50% и 0,4%.
2. Эталон крови (внутренней средой организма человека и животных) 10 мкл добавить в каждую пробирку, перемешать, чтоб получить гомогенную смесь клеток крови (внутренней средой организма человека и животных) (рис 6).
3. Опосля 20 минут темостатирования при температуре опыта, измерить оптическую плотность на 680 нм относительно воды. См. Рис. 6-8.
Расположено на /
Расположено на /
Расположено на /
Расположено на /
Расположено на /
Расположено на /
2.5 способы обработки экспериментальных данных
характеристики гемолиза.
Для оценки конфигураций кривых гемолиза опосля обработки эритроцитов пероксиазотистой кислотой и при изменении температуры нами были введены два параметра: процентом содержания NaCl и растворе при 50% гемолизе(b50%), и шириной зоны гемолиза (b)
характеристики гемолиза оценивали по кривой гемолиза с внедрением уравнения Больцмана
Где y-процент гемолизированных эритроцитов, А1-начальное области гемолиза.
Статистическая обработка экспериментальных данных
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась по обычным методикам программки Exel (n=38, p=0.95).
2.6 Применяемые компьютерные программки
В подготовке данной работы использовались программки Origin, Mathcad, Exel, .Word.
осмотический эритроцит температура
3.Основная часть
3.1 Осмотические характеристики эритроцитов в интервале температур 5-37?С
Зависимость процентного содержания гемолизированных клеток в суспензии эритроцитов от концентрации NaСl в растворе имеет S-образный вид (рис.9). При уменьшении температуры суспензии эритроцитов с 370С до 50С наблюдалось повышение параметра b50%. Форма кривых гемолиза фактически не изменялась (параметр b изменялся некординально) (таблица 2).
Как указывает обзор литературных данных, конформационная подвижность макромолекул в мембране зависит от температуры. С уменьшением температуры среды конформационная подвижность макромолекул в мембране миниатюризируется. Вследствие этого меняются транспортные процессы через эритроцитарную мембрану, эритроцит становится наиболее чувствительным к осмотическому стрессу. Это проявляется в увеличении параметра b50%.
Таковым образом, при низких температурах эритроциты стают наиболее хрупкими, что обосновано понижением подвижности молекул в мембране.
Рис.9. Зависимость относительной концентрации гемолизированных эритроцитов от относительной концентрации NaCl в аква растворе (кривая гемолиза) при температурах ниже физиологических
Таблица 2. Зависимость характеристик гемолиза от температуры
Температура, 0С
b50%, %
b, %
5
0,536±0,002
0,020±0,002
16
0,524±0,003
0,018±0,003
37
0,485±0,002
0,025±0,003
3.2 Осмотические характеристики эритроцитов при температуре 50?С
При температуре 50С происходит денатурация спектрина, белка цитоскелета клеточки [4]. Денатурация спектрина инициирует структурные перестройки в мембране, вследствие чего же нарушается транспорт веществ через мембрану. По нашим данным параметр b50% сдвигается в сторону изотонических концентраций, а параметр b возрастает (таблица 3). Ширина зоны гемолиза охарактеризовывает степень кооперативности процесса гемолиза. Изменение степени кооперативности процесса гемолиза свидетельствует о нарушении интеграции транспортных действий через эритроцитарную мембрану.
Таблица 3. Зависимость характеристик гемолиза от температуры
Температура, 0С
b50%, %
b, %
37
0,485±0,002
0,025±0,003
50
0,448±0,010
0,051±0,007
3.3 Сравнительный анализ конфигурации осмотических параметров эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса)
Модифицирование молекул при окислительном температуры. В наших опытах параметр b50% увеличивался при уменьшении температуры в спектре температур 5 — 50 0С (Табл. 4). Понятно, что при уменьшении температуры в этом спектре вязкость эритроцитарных мембран возрастает.
действие пероксиазотистой кислоты (концентрация реагентов — 5 мМ) и при одновременном увеличении температуры суспензии с 16 до 37 0С фактически компенсирует конфигурации параметра b50% этими факторами по отдельности. Как следует, уменьшение осмотической стойкости эритроцитов (повышение b50%) при обработке эритроцитов пероксиазотистой кислотой в больших концентрациях соединено с уменьшением подвижности молекул мембран эритроцитов.
Параметр b возрастает при денатурации спектрина (при инкубации суспензии эритроцитов при 50 0С в течение 10 минут), белка цитоскелета эритроцита, выполняющего функцию интегральной связи неких транспортеров эритроцитарной мембраны, таковых как белок полосы 3. Параметр b является чувствительным к низким концентрациям пероксиазотистой кислоты. Понятно, что пероксинитрит в низких концентрациях видоизменит некие ферменты, ответственные за уровень фосфорилирования белков в эритроците [18], что оказывает специфичное воздействие на транспорт воды и ионов через эритроцитарную мембрану. Одновременное действие пероксиазотистой кислоты и температуры (500С), при которой происходит денатурация спектрина, вызывает фактически полную утрату соответствующих для эритроцита осмотических параметров.
Таблица 4. Зависимость характеристик гемолиза от температуры
Температура,0С
b50%,%
b.
5
0,536±0,002
0,020±0,002
16
0,524±0,003
0,018±0,003
37
0,485±0,002
0,025±0,003
37 + 5мМ NaNO2 и H2O2
0,518±0,005
0,023±0,005
50
0,461±0,002
0,051±0,007
Заключение
1. Выявлено уменьшение осмотической стойкости эритроцитов в суспензии (повышение параметра b50%) при уменьшении температуры с физиологической до 5С. При всем этом форма кривой гемолиза не изменяется [20].
2. Денатурация спектрина при инкубации суспензии эритроцитов при 50С в течение 10-15 минут, вызывает повышение параметра b, что свидетельствует о нарушении интеграции транспортных действий через эритроцитарную мембрану.
3. Сравнительный анализ конфигураций характеристик гемолиза при изменении температуры и при окислительном стрессе (В медицине, физиологии, психологии выделяют положительную (эустресс) и отрицательную (дистресс) формы стресса) дозволил прийти к выводу о том, что активные формы азота и кислорода, образующиеся в системе NaNO2 и H2O2 в закисленных смесях, являются регуляторами осмотических параметров эритроцитов благодаря уменьшению подвижности мембранных молекул, также благодаря понижению уровня кооперативности действий транспорта воды и ионов в эритроцитах.
Перечень литературы
1. Короткая мед энциклопедия. Т.2 / Под редакцией А.Н. Покровского.- М.: «Премьера», 1999.- 1200 с.
2. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов // Ж.-К. Стокле, Б. Мюлле, Р. Андрианцитохайна, А. Клещев // Биохимия.- 1998.- Т. 63, № 7.- С. 976-983.
3. Red cell membrane transport in health and disease / Eds. Ingolf Bernhart, J Clive Ellory.- Stringer, 2003.- 748 p.
4. Черницкий Е.А., Воробей А.В. структура и функции эритроцитарных мембран.- Мн.: Наука и техника.- 1981, 216 с.
5. Тоддоов И. Клинико-лабораторные исследования в педиатрии.- М.: мир.- 1968.- 1064 с.
6. Наследные анемии.// www.cadioline.ru
7. Новиков В. Е. Оценка развития отёка-набухания мозга и эффективности его фармакотерапии по гематологическим показателям // www.smolensc.ru/User/sgma/mmorph/n-1-h+l/17/htm
8. Васильева Е.М., Баканов М.И., Гордеева Г.Ф.,. Поддубная А.Е, Шор Т.А Фосфолипидный состав эритроцитов при неврологических нарушениях у малышей; воздействие сопутствующей патологии // www.surgeon.spb.ru/sno/pirogov/vest/05_pediatria.pat
9.. Киеня А. И HTTP//mglinets/narod/ru/gen/aquoporon.htm.
11. James A.Thomas / Lectures on oxidative stress for students of Iowa state university, Department of Biochemistry and Biophysics.
12.Управление по исследованию био окисления полярографическим способом.- М.: Наука.- 1973.- 221 с.
13 Газовый обмен и транспорт газов //www.cadioline.ru
14. Nitric oxide diffusion in membranes determined by fluorescence quenching / A. Denicola, J. M. Souza, R. Radi, E. Lissi // Arch. Biochem. Biophys.- 1996.- Vol. 328, № 1.- P. 208-212.
15. Wrobell A., Ukaszynska B., Kedzeirska I. The effect of peroxynitrite and some antioxidants on the rate of osmotic hemolysis of bovine erythrocytes // Cellular and molecular biology letter.- 2003.- №8.- P. 455-460.
16. Starodubtseva M. N., Cherenkevich S. N., Semenkova G. N. Chemiluminescence of acidified solution of sodium nitrite and hydrogen peroxide In: Chemiluminescence at the turn of the millennium: An indispensable tool in modern chemistry, biochemistry and medicine, Schweda-Werbedruck GmbH, Druckerei & Verlag, Dresden, 2001,- P. 76-81.
17. Osmotic hemolysis //www. Medicine.mcgill.ca/physio/vlabioline/bloodlab.
18. Mallozzi, C., Di Stasi, A. M., Minetti, M. // FASEB J. 1997. V. 11. P. 1281-1290.
19. Божок Т.Н. Оценка состояния окислительно-восстановительной системы эритроцитов человека при действии активных форм азота.- Курсовая работа, 4 курс.- Гм., 2003 .- 29 c.
20. Божок Т.Н, Стародубцева М.Н. Температурно-концентрационная
]]>