(5 оценок, среднее: 4,80 из 5)
Загрузка...
Учебная работа. Авторадиография. Введение радиоактивной метки в биологические препараты
Реферат на тему:
Авторадиография.
Введение радиоактивной метки в био препараты
Авторадиография
Основное предназначение авторадиографии — регистрация полос радиоактивно меченых препаратов (белков и НК) опосля электрофореза. Для данной цели употребляют мед «неэкранированную» рентгеновскую пленку (в пленках с защитным слоем на поверхности поглощается часть излучения). Почернение рентгеновской пленки (опосля проявления) происходит как под действием электронов, так и у-излучения. Препараты, меченые тритием, ввиду малой проникающей возможности его (3-электронов, только в случае весьма больших интенсивностей излучения удается регистрировать данным способом. Авторадиография препаратов, меченых S и С осуществляется полностью удачно. Но пластинки ПААГ в этих вариантах нужно перед регистрацией радиоактивности на сто процентов высушивать. В неприятном случае Р-электроны, испускаемые в глубине геля, не достигнут пленки. Сушат гель, уложив его на толстую фильтровальную бумагу (он прилипает и при сушке не ежится), 1-2 часа в вакууме и с нагреванием либо 36 часов на воздухе при комнатной температуре — до состояния узкой, крепкой и прозрачной пленки. Тем не наименее, не нужно, чтоб толщина мокроватого геля превосходила 0,4 мм.
Рентгеновскую пленку накладывают эмульсией прямо на гель. В таковой постановке опыта Р-электроны углерода и серы попадают в слой эмульсии на глубину около 0,25 мм. Для неплохого прилегания пленки к гелю под крышку соответственной кассеты с пружинными зажимами кладут прокладку из губчатой резины. Саму кассету заворачивают в черную бумагу. Экспозиция продолжается несколько дней. Потом следует, как обычно, проявление и фиксация.
Энергия Р-излучения радиоактивного фосфора довольно велика, чтоб его авторадиографию можно было вести прямо с увлажненной пластинки геля. Гель, покрытый пленкой, оставляют на одной из стеклянных пластинок, заворачивают в узкий целофан и выставляют, как было описано выше, в течение нескольких часов — лучше на холоде (-20°), с тем, чтоб помешать расплыванию полос в геле во время экспозиции за счет диффузии. Р-электроны радиоактивного фосфора могут проходить в материале рентгеновской пленки до глубины в 6 мм. Это значит, что большая часть их «прошивает» пленку, не передав всю свою энергию молекулам бромистого серебра и, как следует, не самым наилучшим образом регистрируются. время от времени, если интенсивность Р-излучения невелика (за малостью содержания), эти «пропадающие напрасно» электроны улавливают при помощи фосфоресцирующего экрана, который устанавливают по другую сторону пленки. Попавшие на экран Р-электроны вызывают его свечение и пленка регистрирует (не без некого размытия изображения) к тому же светящуюся полосу на дисплее. Зато яркость почернения в этом случае может возрости в 5-8 раз.
Так как при использовании флюоресценции экрана вероятна лучше проводить в этом случае при — 70°.
Для правильного совмещения пленки опосля проявления с начальным гелем, на нем до авторадиографии делают две пометки по углам радиоактивными чернилами.
Сцинтилляционные счетчики излучения
способ авторадиографии имеет два суровых недочета. Во-1-х, недозволено количественно оценить интенсивность радиоактивного излучения. Степень почернения полос для этого аспект очень твердый. Во-2-х, фактически нереально в почти всех вариантах авторадиографией зарегистрировать излучение трития
Оба эти недочета снимаются при использовании жидкостных сцинтилляционных счетчиков. Мысль состоит в том, чтоб растворить радиоактивно-меченое вещество в воды, которая на действие Р-электронов, владеющих даже относительно малой энергией, отвечала бы вспышками света. Эти вспышки могут быть зарегистрированы высокочувствительными фотоэлементами. Таковая жидкость называется сцинтиллятором, а сами вспышки — сцинтилляциями. Принцип деяния тут прост. Электрон, вылетевший из ядра радиоактивного атома, входящего в состав некоторой био молекулы, сходу же попадает в водянистую среду, где он обречен столкнуться на пути собственного полета (пусть он будет измеряться только толиками мм) с молекулами сцитиллятора. Большая часть таковых столкновений приведет к передаче части кинетической энергии электрона какому-либо «просто возбудимому» внешнему электрону сцинтиллятора. Быстрее всего электрону, участвующему в реализации сопряженных двойных связей в ароматичной молекуле, к примеру, толуола либо нафталина. Обыденное «время жизни» такового электрона в возбужденном состоянии — порядка 10~8 сек» опосля что он ворачивается к собственному нормальному положению, отдавая полученную «лишнюю» энергию средством испускания кванта света.
Электроны летят весьма стремительно. Потому интервалы меж возникновением фотонов (на пути просвета электрона) будут настолько малы, что не только лишь человечий глаз (если б этот свет оказался в видимой области), да и электрические регистрирующие приборы воспринимают эту цепочку вспышек, как один световой импульс. Сколько радиоактивных распадов в препарате случится за 1 минутку, т.е. сколько электронов в минуту прочертят свои линии движения в сцитилляторе, столько же электронных импульсов зарегистрирует высокочувствительный счетчик излучений.
В качестве такого употребляют не фотоэлементы (их чувствительность очень мала), а фотоумножители (ФЭУ). С этими устройствами вас должны познакомить в курсе физики. Мысль их устройства заключается в том, что в торце, снутри откаченного до высочайшего вакуума цилиндра имеется фотокатод, который даже при попадании на него единичного фотона испускает, как минимум, один электрон. Под действием мощного электронного поля этот электрон разгоняется и ударяет в 1-ый «динод» — железную пластинку, покрытую особенным составом, способным «ответить» на удар стремительно парящего электрона испусканием порядка 5-ти «вторичных» электронов. Они все, в свою очередь, разгоняются электронным полем и ударяют во 2-ой динод. Из которого вылетает уже около 25-ти электронов. Такое умножение числа электронов происходит на 8-10 «каскадах». Так, что на стоящий в конце цилиндра анод обрушивается целая «лавина» электронов, порожденная хоть какой весьма слабенькой и недлинной вспышкой света. Лавина электронов просто преобразуется во полностью осязаемый и настолько же маленький, как начальная вспышка света, импульс напряжения. Дальше следует усилитель этого напряжения и электрический счетчик импульсов, успевающий регистрировать почти все тыщи импульсов в секунду. По окончании данного времени счета (к примеру, 1 минутки) счетчик останавливается и указывает конечный итог счета (в имп/мин).
Выше была изготовлена обмолвка: «если б этот свет был лицезреем глазом». Он не лицезреем поэтому, что лежит в ультрафиолетовой области. Таковой дальной, что его не регистрирует обыденный ФЭУ. Но коротковолновое излучение можно без усилий перевоплотить в наиболее длинноволновое при помощи люминофоров — веществ, отвечающих на поглощение маленьких волн света испусканием наиболее длинноватых волн. В сцинтиллятор добавляют в маленьком количестве (-0,5%) такие люминофоры, которые в два шага, но одномоментно переводят начальную вспышку света с длиной волны около 310 тц во вспышку с длиной волны 420 mi, отлично регистрируемую ФЭУ.
метод регистрации энергетически слабенькой радиоактивности (ЗH) и оценки ее удельной активности (числом имп/мин) кажется найден, но появляются некие трудности, о преодолении которых следует упомянуть. Я не случаем именовал выше в качестве первичных сцинтилляторов толуол и нафталин. Конкретно им по ряду обстоятельств отдается предпочтение. Но нафталин — это жесткое вещество. К Счастью, его до концентрации 6-10% по весу можно растворить в диоксане. А диоксан отлично смешивается с водой и не теряет данной возможности, если в нем растворен нафталин. Это — значительно, потому что большая часть био препаратов исследуется в виде аква смесей.
То, что во флаконе со сцинтилляторной жидкостью только 10% растворенного вещества является, фактически говоря, сцинтиллятором, не сказывается на эффективности счета импульсов. «Действенных» столкновений все-же оказывается довольно много, а все они равно соединяются в единую вспышку света. Ну как быть со сцинтиллятором на базе толуола? В этом случае вся жидкость во флаконе является первичным сцинтиллятором, но… она не смешивается с водой. Делему удается решить добавлением в толуол, в соотношении 1: 3 либо даже 1: 2, детергента Тритон Х-100. Если количество аква раствора радиоактивного продукта не превосходит 2,8 мл на 20 мл сцинтиллятора, то выходит настоящий раствор, и эффективность счета импульсов фактически не понижается.
задачка, кажется, решена. Довольно в стеклянный флакон, емкостью в 25 мл залить один из 2-ух сцинтилляторов, добавить в количестве 2-2,5 мл аква раствор радиоактивно меченого био продукта, поставить этот флакон в полной мгле (в глубине отлично закрытого от света устройства) перед фотокатодом ФЭУ и можно считать импульсы. Но не тут-то было. Так как нужно считать с большенный точностью иногда весьма малые уровни радиоактивности, то вмешивается неизменный «неприятель» всех высокочувствительных электрических устройств — так именуемый «свой шум» частей, образующих эти приборы. В том числе «шумит» и ФЭУ. Физическая причина этого лежит в том, что из фотокатода, без всякого освещения, а лишь за счет собственных термических движений безпрерывно, с большенный частотой и совсем хаотически вылетают электроны. Они здесь же подхватываются мощным электронным полем, множатся, как описано выше, и дают неверные, «темновые» импульсы напряжения, которые благополучно регистрируются счетчиком импульсов. Этот «темновой счет» может во много раз превосходить счет регистрируемой радиоактивности (он добивается величины порядка 105 имп/мин). Такая «плата» за высшую чувствительность!
Но электроника отыскала выход и из этого, чудилось бы, безвыходного положения. Флакон с продуктам ставят меж 2-мя фотоумножителями. Импульсы напряжения с всякого из их подаются сразу на электрическое устройство, именуемое «схемой совпадений». К огорчению, школьный курс физики (боюсь, что и курс био факультета) не дозволяет тут обрисовать это весьма обычное, но замечательное изобретение. Остается лишь сказать, что оно производит. Оно пропускает (в виде одиночного импульса) в последующую за ним электрическую цепь два импульса напряжения, приходящие на два его «входа» строго сразу — с точностью до 10~8 сек. Я упомянул, что ФЭУ гремят хотя и с большенный частотой следования шумовых импульсов, но хаотически. Потому возможность того, что два шумовых импульса придут на входы схемы совпадений сразу (с обозначенной точностью) весьма мала. В итоге число регистрируемых шумовых импульсов падает чертовски — до 3-5 имп/мин. А вспышку света в сцинтилляторе оба ФЭУ «лицезреют» и регистрируют совершенно сразу!
Вообщем, есть и остальные источники неверного счета импульсов. к примеру, галлактические лучи. Они пролетают через флакон со сцинтиллятором и порождают вспышку света. Для защиты от их флакон, опускающийся для просчета в глубину устройства, защищен там толстой свинцовой «броней».
Электроника дозволяет добиться еще 1-го, не наименее восхитительного результата. Если в сцинтиллятор заносить сразу два продукта, из которых один, например, помечен, а 2-ой — радиоактивным углеродом, то современный 2-х канальный счетчик излучений может зарегистрировать в собственных 2-ух каналах одну и другую радиоактивность порознь. тут игра идет на различии амплитуд импульсов тритиевого и углеродного происхождения. Оно проистекает из различия энергий Р-электронов, а означает и из различия яркости соответственных вспышек света. Это различие преобразуется в различие амплитуд начальных импульсов напряжения, снимаемых с анодов обоих ФЭУ. На входе всякого из 2-ух каналов счетчика (опосля общего подготовительного усилителя напряжений) стоят по два, так именуемых, «пороговых ограничителя». один из их («верхний порог») не пропускает к счетчику импульсы напряжений, величина которых больше некого наперед данного значения. 2-ой («нижний порог») «отрезает» все импульсы, которые меньше другого, тоже наперед данного значения. Все эти четыре ограничителя (в 2-х каналах) инсталлируются экспериментатором зависимо от того, какая пара изотопов просчитывается. В итоге таковой регулировки в один канал для счета поступают импульсы лишь от наиболее массивного излучателя, а в иной — лишь от слабенького. При регулировке учитывается и неминуемое частичное перекрытие распределений по энергиям для Р-электронов из обоих источников. С данной целью распределение для массивных импульсов отчасти «отрезается» снизу — со стороны импульсов наименьшей амплитуды. А регистрация слабеньких импульсов ограничивается «сверху» — не проходит часть более «больших» импульсов данной группы. В итоге счет числа импульсов обеих категорий несколько занижается, но они оказываются разведенными в различные каналы. Поправочные коэффициенты на такое занижение устройство заносит автоматом, просчитав за ранее (при установленных порогах) эталонные эталоны всякого из 2-ух видов применяемой радиоактивности. Результаты печатаются на ленте в отдельных столбцах.
В автоматический устройство можно при помощи многозвенной цепи железных гнезд устанавливать до 2-ух сотен нумерованных флаконов, которые просчитываются поочередно без роли оператора (к примеру, ночкой).
На рис. 1 изображена принципная электронная схема 2-х канального счетчика излучений. Обозначения: 1 — флакон с продуктам, 2 — ФЭУ, 3 — схема совпадений, 4 — усилитель напряжения, 5 — нижние пороги, 6 — верхние пороги, 7 — счетчики числа импульсов для каналов А и В.
А В
Рис. 1.
Счет радиоактивности на фильтрах
Если синтез белка либо нуклеиновой кислоты ведут в полной ферментативной системе in vitro (в пробирке) с внедрением радиоактивно меченых низкомолекулярных предшественников, то оценить включение радиоактивности в биополимер можно с внедрением счета радиоактивности конечного продукта на фильтре. Для задержания белков либо нуклеиновых кислот опосля осаждения их из обскурантистской консистенции трихлоруксусной кислотой (ТХУ) либо этанолом можно применять фильтры из толстой фильтровальной бумаги либо стекловолокна с размером пор 0,45-1,2 ц. 2-ой вариант подразумевает внедрение имеющихся в продаже мембранных фильтров из нитроцеллюлозы (без осаждения). В этом случае задержание продукта реакции на фильтре обосновано его сорбцией. Нитроцеллюлоза крепко сорбирует щелочные белки, рибосомы и однонитевые (денатурированные) молекулы ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов). Необходимо подчеркнуть, что в случае использования картонных либо стекловолокнистых фильтров часть радиоактивного продукта просачивается в глубь фильтра, а на мембранном — весь он узкой пленкой распределяется по поверхности. Исходя из убеждений надежного контакта со сцинтиллятором 2-ой вариант лучше. Но мембранные фильтры намного дороже картонных либо стекловолокнистых.
Для данной цели комфортны фильтры поперечником 24 мм, что дозволяет просто заносить их во флаконы сцинтилляционного счетчика. Фильтрование производят при помощи обычного устройства, изображенного на рис.2.
Рис. 2.
В пробирку Бунзена (1) вставляют на резиновой пробке кольцевую подложку для фильтра (2) из нержавеющей стали в виде сетки с кольцевым шлифованным фланцем. На нее кладут фильтр (3), а на фильтр ставят резервуар (4), выточенный из таковой же стали и тоже со шлифованным фланцем. Фланцы сжимают пружинными зажимами (не показаны). Таковая просто разборная система комфортна для манипуляций с фильтром.
В резервуар заливают обскурантистскую смесь со взвешенным в ней осадком исследуемого продукта (в первом варианте) либо без осадка (во 2-м варианте) и при маленьком разрежении отсасывают жидкость. Радиоактивные предшественники вымывают 5-6 раз сменяя в резервуаре промывную жидкость, не способную растворить осадок. (к примеру, ту же, в какой велось осаждение полимера)
Если фильтров много, то, пронумеровав их за ранее по краю карандашом, можно промывку вести «в объеме», большенными партиями, сменяя промывную жидкость любые 15 минут и временами встряхивая ее. Крайние промывки в любом случае ведут этанолом, потом эфиром для полного удаления воды во время следующей сушки фильтров. Это в особенности принципиально для «больших»: картонных и стекловолокнистых фильтров, где вода обязана быть на сто процентов удалена из внутренних пор, потому что просчет радиоактивности осадка на фильтре ведут во флаконе с незапятнанным толуоловым сцинтиллятором. Остатки воды в порах могут преградить сцинтиллятору доступ к радиоактивному веществу. Отлично высушенный фильтр в толуоловом сцинтилляторе смотрится однородно полупрозрачным. Сушку ведут на воздухе при комнатной температуре 15-20 минут (до исчезновения аромата эфира).
Положение «большого» фильтра во флаконе, — лежа на деньке либо стоя на ребре, — не играет значимой роли. Вспышки света при испускании (3-электронов все равно «засвечивают» всю жидкость во флаконе и будут увидены обоими ФЭУ. Вообщем, мембранный фильтр, все-же, лучше положить на дно пленкой вещества ввысь.
В случае малых размеров инкубационной консистенции даже в первом варианте использования фильтров не непременно проводить реакцию и осаждение полимера в объеме для следующего сбора осадка фильтрованием. До 50 мкл обскурантистской консистенции можно просто нанести на картонный фильтр и отдать воды впитаться. Эту операцию можно провести за один прием для нескольких 10-ов пронумерованных фильтров, ряд за наколотых булавками на слой резины, так чтоб они ее не касались. Потом резину с фильтрами помещают во мокроватую камеру, термостатированную при температуре ферментативной реакции. По ее окончании фильтры совместно с булавками снимают и помещают в большенный стакан, заполненный 5%-ным веществом ТХУ либо этанолом. Осаждение полимера будет происходить снутри фильтров. (С булавок фильтры снимать не следует, потому что булавки защищают их от слипания) Там же, в стакане создают и все промывки. Потом фильтры опять накалывают на резину, сушат и помещают во флаконы со сцинтиллятором в порядке их номеров.
Очевидно, при использовании фильтров эффективность счета понижается по сопоставлению с просчетом продукта, растворенного в сцинтилляторе. Некая часть энергии (3-электронов пропадает на соударения с материалом осадка и пространственной сетью фильтра. Но Р-электрон, потерявший часть энергии, совсем не непременно уже неспособен вызвать световую вспышку в сцинтилляторе. А для счета принципиально лишь число импульсов за минуту, а не их амплитуда (кроме счета двойной метки). Тем не наименее, следует надзирать тормозящие причины — толщину и плотность осадка, также и самого фильтра, с тем, чтоб по способности уменьшить число импульсов, оказавшихся не просчитанными из-за очень большенный утраты энергии по дороге к сцинтиллятору.
Введение радиоактивной метки в био препараты
a) In viuo.
Проще всего предоставить непростую, а время от времени и опасную операцию введения метки самой природе. Для этого в питательную среду заносят радиоактивно меченый предшественник синтеза интересующего нас вещества в организме. Проще всего это создать для микробов. Меченый по тимидин за 1 час просто врубается в ее ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) до уровня, составляющего около 10% внесенной в среду радиоактивности. Буквально так же метят ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) в звериных клеточках, возрастающих в культуре ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология).
Импульсную метку в иРНК микробов производят методом введения в питательную среду С-урацила либо такого же Р-ортофосфата — опосля исчерпания либо отмывки нерадиоактивного фосфора. Ввиду быстроты протекания действий метаболизма у микробов длительность такового импульса обязана быть маленький (10-30 сек.). Опосля что жизнедеятельность микробов нужно немедля закончить, к примеру, вылить их суспензию на мелко раздробленный лед, содержащий азид натрия.
Метку в бактериальные белки, как и в белки высших организмов в культуре клеток, удобнее всего заносить при помощи меченого по С либо S метионина. Напомню, что метионин является неподменной аминокислотой (т.е. не синтезируется в самом организме) для клеток всех высших звериных и неких микробов. Не считая того, с него начинается синтез хоть какого белка, что дозволяет смотреть за началом этого процесса.
Введение метки через диету звериных фактически не употребляется, потому что радиоактивные изотопы по путям метаболизма врубаются во почти все био молекулы. Не считая того разбавление радиоактивной метки происходит за счет собственных припасов организма, к примеру, неподменных аминокислот, приобретенных в итоге катаболизма (расщепления) собственных белков. Все это просит огромного расхода дорогостоящих радиоактивных препаратов и соединено с завышенной степенью радиационной угрозы.
тут уместно увидеть, что радиоактивная метка вводится, поточнее сказать, создается в аминокислотах, нуклеотидах и остальных био важных молекулах методом специального облучения в атомных реакторах. Сборники специализированных забугорных компаний содержат почти все сотки наименований радиоактивно меченых молекул. Чего же, к огорчению, недозволено сказать о российскей продукции. б) In vitro.
Введение радиоактивной метки в уже очищенные белки либо нуклеиновые кислоты можно создавать и в лабораторных критериях при помощи хим реакций замещения либо присоединения радиоактивных атомов, а время от времени и обычных радиоактивно меченых молекул. Эти реакции довольно сложны и разглядывать их тут не имеет смысла. Почаще введение метки осуществляется в процессе идущих in vitro ферментативных реакций синтеза биополимеров с внедрением радиоактивно меченых предшественников (Р-АТФ, аминокислот, нуклеозидтрифосфатов и проч.) Некие из ферментов присоединяют лишь одно меченое звено на конец цепи соответственного полимера.
Остальные ферменты, ведущие в пробирке комплементарный синтез биополимеров (ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов)-полимеразы, РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов)-полимеразы, рибосомальные комплексы) при наличии радиоактивно меченых мономерных предшественников (рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, аминоацил-тРНК) могут включать радиоактивную метку во все либо некие звенья полимерных цепей, придавая им весьма высшую степень радиоактивности.
В заключение необходимо подчеркнуть, что по причинам сохранности и удобства детектирования результатов биосинтеза в крайние годы появилась тенденция к подмене радиоактивной метки на флюоресцентную, что мы уже следили на примере эволюции способа секвенирования ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов).
Литература
Авдонин П.В., Ткачук В. А, нервные (относящиеся к пучкам нервов) импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри и внутриклеточный кальций. 1994. — Наука, Москва. — С.29-42.
Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементы человека, Медицина. М. — 1991.
Анестиади В.Х., Нагорнев В.А. О пато- и морфогенезе атеросклероза (атеросклероз — хроническое заболевание артерий эластического и мышечно-эластического типа). Кишинев, медицина. — 1985. — С.92.
Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. — М.: медицина, 1982.
Аронов Д.М., Бубнова Н.Р., Перова Н.В. и др. Воздействие ловастатина на динамику липидов и аполипротеидов сыворотки крови (внутренней средой организма человека и животных) опосля наибольшей физической перегрузки в период пищевой липемии у нездоровых ИБС // Кардиология, — 1995. — Т.35. — N 31. — С.38-39.
Атаджанов М.А., Баширова Н.С., Усманходжаева А.И. Диапазон фосфолипидов в органах-мишенях при приобретенном жизни в норме и при патологиях, то есть о закономерностях функционирования и регуляции биологических систем разного уровня организации) и эксперим. оздоровление»>терапия (Терапия от греч. [therapeia] — лечение, оздоровление). — 1995, — N 3: — С.46-48.
]]>