Загрузка...
Учебная работа. Бактериофаги, особенности строения и практическое применение
Курсовая работа
по теме:
«Бактериофаги. Индивидуальности строения и практическое применение»
Содержание
Введение
1. История открытия бактериофагов
2. Индивидуальности строения
3. Актуальный цикл фага
4. Взаимодействие фага с бактериальной клеточкой
4.1 Редуктивная простейшими»>
4.2 Общая трансдукция
4.3 Специфичная трансдукция
5. Способы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация
5.1 Выделение фага из объектов окружающей среды
5.2 Высококачественный способ определения фагов E.coli
5.3 Количественный способ — определение титра фага по способу Грациа
5.4 Определение диапазона литического деяния фага
5. 5 Фаготипирование микробов
5.6 Определение лизогении
6. Практическое применение
Заключение
Перечень литературы
Введение
У всякого жителя Вселенной свое предназначение: все в природе гармонически и взаимосвязано, все имеет свои логические связи и просит баланса, чтоб жить в равновесии и гармонии.
человек, как все остальные живы существа, подвержен инфецированию вирусами. Вирусные эпидемии и даже пандемии не раз поражали население земли, приводя к многомиллионным жертвам (натуральная оспа, грипп, желтоватая лихорадка, клещевой энцефалит и др.). В конце XX века человек столкнулся с возбудителями целого ряда ранее неведомых зараз — вирусами геморрагической лихорадки Эболла, гепатитов В, C, D и E, атипичной пневмонии, птичьего и свиного гриппа. А сначала 80-ых гг. началась новенькая эпидемия, которую вызвал вирус иммунодефицита человека (ВИЧ ). Нужно признать, что одной из важных заморочек в заразной патологии человека являются вирусные заболевания . Вирусы обычно рассматриваются как паразиты возбудители заразных заболеваний, наносящих вред человеку, звериным, растениям. Но таковой подход является односторонним, и его недозволено именовать правильным. В 70-ых годах Ждановым В.М. была высказана догадка, согласно которой вирусы являются принципиальным фактором эволюции органического мира. Преодолевая видовые барьеры, вирусы могут переносить отдельные гены либо группы генов, а Интеграция вирусной ДНК с хромосомами клеток может приводить к тому, что вирусные гены стают клеточными генами, выполняющими принципиальные функции.
неувязка вирус клеточка издавна вышла за рамки вирусологии и заняла одно из основных мест в науке о жизни. Самые большие успехи в этом направлении были достигнуты в исследовании системы бактериальный вирус — микробная клеточка. Это разъясняется простотой культивирования системы, маленьким периодом генераций, высочайшим выходом потомства и возможностью очень четкого его количественного учета.
Особенная роль бактериальных вирусов определяется тем вкладом, который был внесен при их исследовании в решение общевирусологических вопросцев. Исследования на бактериофагах (вирусах, размножающихся в микробах) принесли плодотворные результаты и в разрешение важных заморочек молекулярной биологии и молекулярной генетики. С помощью их было подтверждено, что вещественным носителем наследственности является ДНК , открыт парадокс модификации — рестрикции, открыта транскрипция, проведены важные исследования по исследованию репликации, рекомбинации, морфогенезу. бактериальный фаг вирус
Не считая того, на бактериальных вирусах были проведены широкие радиобиологические исследования. Бактериофаги оказались также комфортным объектом для первичного отбора противоопухолевых препаратов. В конце концов, фаги с фуррором применены для био исследовательских работ галлактического места.
В крайние годы вновь возрос Энтузиазм к вирусам микробов в мед практике. С одной стороны это соединено с все наиболее широким их применением в качестве фармацевтических препаратов на фоне нарастающего распространения штаммов микробов с множественной фармацевтической устойчивостью, а с иной — с внедрением бактериофагов в качестве санитарно-показательных микробов для ряда объектов.[1]
1. История открытия бактериофагов
Бактериофамги () (от греч. цЬгпт — пожирать) — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клеточки. Почаще всего, бактериофаги плодятся снутри микробов и вызывают их лизис.
Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с микробами, заканчивающийся весьма нередко их разрушением (от bacteriophage — пожирающий бактерии).
1896 год — открытие бактериофагов Английским бактериологом Эрнестом Ханкин.
1898 год — бактериофаги изучены русским ученым Николаем Гамалея. В этом же году фаги стали употреблять при способ внедрения лекарств.
1980-е годы Эффективность исцеления антибиотиками существенно понизилась. Бактерии выработали фармацевтическую устойчивость.
Энтузиазм к фаговой для снятия или устранения симптомов и проявлений заболевания»>терапии возобновился.
Начало 2000-х годов — Гленн Моррис — сотрудник Института Мэриленд (США т. е. выделенный из кишечного тракта пожиратель микробов. Следующие наблюдения проявили, что бактериофаги всераспространены везде. Они встречаются везде, где есть бактерии — в почве, воде, пищеварительном тракте человека и звериных, гнойных выделениях и т. п. В особенности много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить фактически хоть какой фаг. Так как естественной средой обитания хоть какого фага является микробная клеточка, жизнь фагов связана с микробами.[1,7]
2. Индивидуальности строения
Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала — одноцепочечной либо двуцепочечной РНК , которые содержатся в клетках всех живых организмов). Размер частиц примерно от 20 до 200 нанометров. Современная систематизация бактериофагов включает 13 семейств, подразделенных наиболее чем на 140 родов, которые содержат наиболее 5300 видов фагов. В истинное время эти вирусы выявлены у большинства микробов, как болезнетворных, так и неболезнетворных, также ряда остальных микробов (к примеру, грибов).
Рис.1. Бактериофаги.
Фаги различаются по форме, структурной организации, типу нуклеиновой кислоты и нраву взаимодействия с микробной клеточкой.
Фагам присущи все био индивидуальности, которые характерны вирусам. Их геном представлен или ДНК , или РНК , которые содержатся в клетках всех живых организмов) и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу или спиральной, или кубической симметрии. Большие фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка — икосаэдр, хвостик — спиральная симметрия). Фаги различаются по форме — нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам — маленькие, среднего размера и большие (рис. 2).
Рис. 2. Разные формы фаговых вирионов (по Г. Шлегелю, 1972):
1 — нитевидная форма (фаг fd); 2 — гексагональная головка с отростком и сократительным чехлом (фаги Т2. Т4, Т6); 3 — гексагональная головка с длинноватым, не способным к сокращению хвостиком; 4 — головка с маленьким отростком (фаги ТЗ, Т7); 5 — октаэдр; 6 — икосаэдр.
Большая часть фагов под электрическим микроскопом имеют форму головастика либо сперматозоида, некие — кубическую и нитевидную формы. размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.
Более много исследованы большие бактериофаги, имеющие форму сперматозоида. Они состоят из вытянутой икосаэдрической головки размером 65-100 нм и хвостового отростка длиной наиболее 100 нм (рис. 3).
Снутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой, снаружи — чехол, способный к сокращению наподобие строения).
1 — головка, 2- хвост, 3 — нуклеиновая кислота, 4 — капсид, 5 -«воротничок», 6 — белковый чехол хвоста, 7- фибрилла хвоста, 8 — шипы, 9 — базальная пластинка.
Фаги состоят из 2-ух главных хим компонент — нуклеиновой кислоты (ДНК либо РНК , которые содержатся в клетках всех живых организмов)) и белка. У фагов, имеющих форму сперматозоида, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали снутри головки.
Белки входят в состав оболочки (капсида), окружающей нуклеиновую кислоту, и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и представлены в виде огромного количества схожих субъединиц, уложенных по спиральному либо кубическому типу симметрии.
Не считая структурных белков, у неких фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные с нуклеиновой кислотой, и белки — ферменты (лизоцим, АТФ — аза), участвующие во содействии фага с клеточкой.[2]
Фаги наиболее устойчивы к действию хим и физических причин, чем бактерии. По степени стойкости к действию разных причин наружной среды и хим веществ фаги занимают пространство меж вирусами и неспоровыми микробами. Они устойчивы в границах рН от 5,0 до 8,0, большая часть из их не инактивируется прохладными аква смесями глицерина и этилового спирта. На их не действуют такие ферментные ядовитые вещества, как цианид, фторид, динитрофенол, также хлороформ и фенол. Фаги отлично сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но просто разрушаются при кипячении, действии кислот, хим дезинфектантов, при УФ облучении.
Высокочувствительны фаги к формалину и кислотам. Инактивация большинства фагов наступает при температуре 65-70 °С. Долгое время они сохраняются при высушивании в запаянных ампулах, замораживании при температуре -185 °С в глицерине.[2,4]
3. Актуальный цикл фага
Различают фаги заразные, т. е. способные вызвать различные формы фаговой инфекции , и неинфекционные (вегетативные ), либо незрелые фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь заразные фаги делят на (находящиеся вне клеточки), способные вызвать продуктивную форму инфекции , и фаги — способные вызывать не только лишь продуктивную, да и редуктивную фаговую заразу.
Актуальный цикл фага может проявляться в форме:
· продуктивной (фаг плодится в клеточке и выходит из нее);
· редуктивной (геном фага просачивается в клеточку, но размножения фага не происходит, его геном встраивается в хромосому клеточки — владельца, становится ее составной частью, т. е. фаг преобразуется в профаг, а клеточка становится лизогенной);
· абортивной инфекции , при которой взаимодействие фага с клеточкой обрывается на какой — то стадии актуального цикла фага, и он гибнет.
Клеточка, несущая профаг, именуется лизогенной, поэтому что профаг, передающийся клеточкой по наследию, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции .
Если в итоге лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клеточки — владельца, она получает новейшие наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости именуют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают лишь умеренные фаги.
Актуальный цикл фага, сопровождающийся продуктивной заразой, складывается из 6 поочередных стадий, любая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких шагов.
1. Адсорбция фагов на клеточной поверхности микробов с помощью специфичных рецепторов (белков — лоцманов), которые размещаются на кончике нити, шипа либо хвостика. В свою очередь, на клеточной стене бактерии размещаются ее фагоспецифические нервные импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри, опознаваемые фагом. Адсорбция фага — пусковой момент его актуального цикла. Она весьма специфична и потому обусловливает возможность практического использования фагов, к примеру для идентификации, микробов, также для целительных и профилактических целей.
2. Проникновение фагового генома через клеточную стену и цитоплазматическую мембрану вовнутрь клеточки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).
3. Установление фагового генома при помощи белка — лоцмана для реализации содержащейся в геноме инфы:
а) однонитевая ДНК — к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; дальше ее кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов);
б) двунитевая ДНК — к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и следующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);
в) РНК , которые содержатся в клетках всех живых организмов) — геном — к трансляционному аппарату для синтеза вирусоспецифических белков (ферментов репликации и структурных).
4. Репликация фаговой геномной ДНК либо РНК , которые содержатся в клетках всех живых организмов).
5. Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.
6. Выход вновь синтезированных фагов из клеточки:
а) методом отпочковывания (М13 — единственный фаг, не вызывающий при выходе из клеточки ее смерти);
б) методом лизиса клеточки изнутри. Он осуществляется вольным лизоцимом и вызывает смерть клеточки.
Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клеточки определяется набором генов у фагов. Большие фаги производят репликацию вполне автономно; средние — отчасти нуждаются в помощи бактериальных генов, а маленькие практически вполне зависят от хромосомных генов.[4]
Морфогенез маленьких фагов протекает по типу самосборки. У больших фагов этот процесс имеет наиболее непростой нрав. К примеру, морфогенез фага Т4 просит активности наиболее чем 40 генов и протекает при участии 3-х самостоятельных линий. На одной из их происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на иной — головки фага (не наименее 16 генов) и на третьей — сборка ворсинок (5 генов). соединение хвостика с головкой не просит роли генов, но оно не может произойти до того времени, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы вполне. Буквально так же ворсинки могут присоединяться к хвостику лишь опосля того, как он объединится с вполне готовой головкой. Благодаря серьезному генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех действий его внутриклеточного размножения.
Выход сформировавшихся фагов почти всегда получается благодаря лизису изнутри вольным лизоцимом. Он синтезируется на самом крайнем шаге размножения фага. время от времени бывает лизис микробов снаружи как следствие адсорбции почти всех фагов на одной клеточке, но при всем этом размножения фагов не происходит. Обычно же опосля внедрения фагового генома в клеточку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекцни данным фагом, т. е. проникновение остальных фаговых геномов становится неосуществимым. Иммунитет обеспечивается особенным цитоплазматическим ре-прессором.[4]
4. Взаимодействие фага с бактериальной клеточкой
По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клеточку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис микробов. процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и очень идентичен с действием взаимодействия вирусов человека и звериных с клеточкой владельца. Но для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, он имеет индивидуальности. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клеточки при помощи фибрилл хвостового отростка. В итоге активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клеточку. В процессе «прокалывания» клеточной стены бактерии воспринимает роль фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вослед за сиим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и интенсивно впрыскивается в цитоплазму клеточки. Другие структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клеточки.
Опосля биосинтеза фаговых компонент и их самосборки в бактериальной клеточке скапливается до 200 новейших фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стены, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клеточки) длится 30 — 40 мин. процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.
Взаимодействие фагов с бактериальной клеточкой характеризуется определенной степенью специфики. По специфики деяния различают поливалентные фаги, способные вести взаимодействие с схожими видами микробов, моновалентные фаги, взаимодействующие с микробами определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариациями (типами) данного вида микробов.
Умеренные фаги лизируют не все клеточки в популяции, с частью из их они вступают в симбиоз, в итоге что ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага именуют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клеточки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследию от клеточки к клеточке неограниченному числу потомков. Био явление симбиоза микробной клеточки с умеренным фагом (профагом) именуется лизогенией, а причин исключаться из хромосомы клеточки и перебегать в цитоплазму, т.е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.
Лизогенные культуры по своим главным свойствам не различаются от начальных, но они невосприимчивы к повторному инфецированию гомологичным либо близкородственным фагом и, не считая того, получают доп характеристики, которые находятся под контролем генов профага. Изменение параметров микробов под воздействием профага получило заглавие фаговой конверсии. Крайняя имеет пространство у почти всех видов микробов и касается разных их параметров: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к лекарствам и др. Не считая того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клеточки и при лизисе крайней переносит эту часть хромосомы в другую клеточку. Если микробная клеточка станет лизогенной, она приобретает новейшие характеристики. Таковым образом, умеренные фаги являются массивным фактором изменчивости микробов.
Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если мельчайшие организмы, применяемые в качестве продуцентов вакцин, лекарств и остальных био веществ, оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неизбежно приведет к лизису производственного штамма.[2,4]
4.1 Редуктивная случае их актуальный цикл складывается из последующих стадий:
а) адсорбция фага на поверхности клеточки;
б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клеточку;
в) веб-сайт — специфичная интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и перевоплощение фага в профаг.
Если 1-ые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции , то 3-я просит роли доп фаговых и хозяйских генов.
Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клеточки лучше всего исследован на примере фага л(лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК , имеющей «липкие» концы (лишниие нуклеотидные последовательности на обратных концах нитей, комплементарные друг другу), потому она может перебегать в кольцевую структуру, нужную для ее включения в хромосому клетки-хозяина. ДНК фага X имеет м. м. около 30 МД, содержит 46 500 нуклеотидных пар и несет 32 гена, 7 из которых кодируют головку, 11 — хвостик, а другие играют регуляторную роль.
Фаг л врубается в хромосому меж генами gal и bio при помощи веб-сайт — специфичной рекомбинации. Она оказывается вероятной поэтому, что ДНК фага имеет особенный участок — attP (от attachment phage — прикрепление фага). Таковой же участок имеется и в хромосоме attB. Он размещен меж генами gal и bio. Участки att имеют сложную структуру и состоят из 250 нуклеотидов. В итоге рекомбинации меж attP и attB, протекающей по механизму кроссннговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому, при этом слева она фланкирована участком attL (от left — левый), а справа — attR (от right — правый), которые образуются вследствие рекомбинации меж attP и attB. Рекомбинация протекает с ролью генов red фага и гесА — бактерии. Для
интеграции требуется также белок фага — продукт гена int (интеграза) и особенный хозяйский белок интеграции. Таковым образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, преобразуется в профаг, а клеточка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клеточку сразу иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. синтез репрессора контролируется фагом. Но профаг спонтанно либо под действием разных причин (хим вещества, облучение УФ , рентгеновскими лучами, завышенная температура) может выходить из хромосомы клеточки и вызывать продуктивную заразу, заканчивающуюся лизисом клеточки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов. Механизм выхода (исключение фага) из хромосомы заключается в том, что происходит рекомбинация меж attL и attR, в итоге которой восстанавливаются attP и attB, а фаговая ДНК воспринимает кольцевидную структуру и исключается из хромосомы. процесс выхода просит роли, кроме обозначенных выше белков, еще 1-го белка — продукта фагового гена xis (ген эксцизии, исключения).
Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом меж микробами. Этот процесс получил заглавие трансдукции. Различают общую (генерализованную, либо неспецифическую) и специфическую трансдукцию.[4]
4.2 Общая трансдукция
Механизм ее состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку быть может случаем включен заместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК , равный по длине фаговой. Это полностью может быть, потому что в инфицированной клеточке биосинтез ее ДНК блокирован, а сама ДНК подвергается распаду. Таковым образом в процессе репродукции фага появляются дефектные вирионы, у каких в головках заместо своей геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют заразные характеристики. Они адсорбируются на бактериальной клеточке, вводят в нее ДНК , содержащуюся в головке, но при всем этом размножения фага не происходит. Введенная в клеточку реципиента донорная ДНК (фрагмент хромосомы донора), если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новеньким признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клеточки — реципиента этот признак наследственно закрепляется.[4]
4.3 Специфичная трансдукция
Различается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги постоянно переносят лишь определенные гены, а конкретно, те из их, которые размещаются в хромосоме лизогенной клеточки слева от attL либо справа от attR. Специфичная трансдукция постоянно связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого либо правого фланга, к примеру либо gal, либо bio. Но в этом случае он должен лишиться такового же размера собственной ДНК с обратного конца, чтоб ее общая длина оставалась постоянной (по другому она не быть может упакована в головку фага). Потому при таковой форме исключения образуются дефектные фаги: A — dgal либо Xdbio.
Специфическую трансдукцию у производит не только лишь фаг лямбда, да и схожие ему лямбдоидные и остальные фаги. Зависимо от места расположения веб-сайтов attB на хромосоме они при собственном исключении могут включать разные бактериальные гены, сцепленные с профагом, и трансдуцировать их в остальные клеточки. Встраивающийся в геном материал может замещать до 1/3 генетического материала фага.
Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клеточки встраивается в ее хромосому и привносит в нее новейший ген (новейший признак), опосредуя не только лишь лизогенизацию, да и лизогенную конверсию.
Таковым образом, если при неспецифической трансдукции фаг является лишь пассивным переносчиком генетического материала, то при специфичной фаг включает этот материал в собственный геном и передает его, лизогенизируя бактерии, реципиенту. Но лизогенная конверсия может произойти и в том случае, если геном умеренного фага содержит такие собственные гены, которые у клеточки отсутствуют, но отвечают за синтез значительно принципиальных белков. К примеру, способностью производить экзотоксин владеют лишь те возбудители дифтерии, в хромосому которых интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox. Он отвечает за синтез дифтерийного токсина. По другому говоря, умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токси — генную.
Фаги плодятся лишь за счет паразитирования в микробной клеточке. Их размножение в бульонной культуре приводит к тому, что несколько часов инкубации при 37 °С становится прозрачной. На плотных средах фаги обнаруживают или при помощи спот — теста, или способом агаровых слоев, предложенным А. Грациа (1936). В первом случае на поверхность агара в чашечке засевают культуру, а потом на нее наносят каплю содержащего фаг материала. Если в нем содержится много вирионов, то на месте нанесения капли будет огромное стерильное пятно spot — пятно; рис. 4).
Рис. 4. Обнаружение бактериофагов в исследуемом материале:
1 — спот-тест; 2 — титрование по Грациа.
Способ агаровых слоев заключается в последующем. Сначала в чашечку наливают слой питательного агара. Опосля застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С 0,7% — ного агара, в который за ранее добавляют каплю концентрированной суспензии микробов и определенный размер суспензии фага. Опосля того, как верхний слой застынет, чашечку помещают в термостат. Бактерии плодятся снутри мягенького слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором отлично видны колонии фага в виде стерильных пятен (рис.4.2). Любая колония появляется за счет размножения 1-го начального фагового вириона. Применение этого способа дозволяет:
а) методом подсчета колоний буквально найти количество жизнестойких фаговых вирионов в данном материале;
б) по соответствующим признакам (размер, прозрачность и др.), учить наследную изменчивость V фагов.
По диапазону деяния на бактерии фаги разделяются на поливалентные (лизируют схожие бактерии, к примеру поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует практически все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии лишь 1-го вида, к примеру фаг Vi — I лизирует лишь возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты микробов снутри вида. При помощи таковых фагов делается более узкая дифференциация микробов снутри вида, с разделением их на фаговарианты. к примеру, при помощи набора фагов Vi — II возбудитель брюшного тифа делится наиболее чем на 100 фаговариантов. Так как чувствительность микробов к фагам является относительно размеренным признаком, связанным с наличием соответственных рецепторов, фаготипирование имеет принципиальное диагностическое и эпидемиологическое
5. Способы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация
Бактериофаги обширно всераспространены в окружающей среде — водоемах, почве. Фаги пищеварительных микробов (пищеварительной палочки, шигелл, сальмонелл) могут быть выделены из сточных вод и испражнений. обнаруживают в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий, вызывающих анаэробную раневую заразу, — в раневом отделяемом, почве. наличие фага в среде показывает на присутствие чувствительных к нему микробов.
Есть вирулентные и умеренные фаги. вызывают продуктивную заразу, заканчивающуюся образованием новейших фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. вызывают интегративную заразу, не приводящую к лизису зараженных ими клеток. ДНК этих фагов врубается в хромосому микробов и передается при их делении неограниченному числу потомков. Таковой тип взаимодействия фага с клеточкой именуют а бактерии, несущие в собственной хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Под действием разных причин в клеточках лизогенных микробов может происходить индукция профага — выщепление его ДНК из хромосомы бактерии и развитие продуктивной инфекции . Лизогенные фаги обширно всераспространены в природе.
Репродукция вирулентного фага в клеточках бульонной бактериальной культуры сопровождается лизисом микробов и просветлением среды. На газоне чувствительных микробов, выращенных на плотной питательной среде в чашечке Петри, фаги образуют зоны очагового либо сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили заглавие либо стерильных пятен — (рис. 5).
Рис.5. Нехорошие колонии (стерильные пятна) бактериофагов:
а — пятна фага Т2; б — пятна фага T1
Они имеют морфологию, соответствующую для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частички при ее внедрении и следующей репродукции в бактериальных клеточках. Любая инфицированная фагом амеба лизируется и высвобождает потомство фага, состоящее из сотен новейших фаговых частиц. Они внедряются в интактные клеточки, и весь цикл повторяется. В итоге лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне возникают нехорошие колонии фага.
Для получения «незапятанной» полосы фага (вольной от примеси остальных фагов) проводят поочередные пассажи морфологически однотипных негативных колоний на газоне 1-го и такого же бактериального штамма.
Большая часть фагов характеризуется в отношении микробов. Но есть фаги, которые могут поражать лишь отдельные варианты 1-го и такого же вида микробов. Их употребляют для определения фаготипов (фаговаров) снутри данного вида. совместно с тем имеются фаги, лизирующие схожие виды микробов.
В
1) фаготипирования микробов, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов микробов 1-го и такого же вида типоспецифическими фагами, что принципиально для маркировки исследуемых микробов при эпидемиологическом анализе болезней;
2) фагоидентификации бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности;
3) фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма хворого (к примеру, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответственных микробов;
4) фагопрофилактики — предупреждения неких болезней (к примеру, дизентерии) посреди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;
5) фаготерапии — исцеления неких заразных болезней, вызванных, к примеру, шигеллами, протеем, стафилококком.[3]
5.1 Выделение фага из объектов окружающей среды
Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская начальный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат совместно с соответственной бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °С в течение 18 — 24 ч. Опосля лизиса культуры оставшиеся бактериальные клеточки убирают центрифугированием либо фильтрацией через бактериальный фильтр. наличие фага в фильтрате определяют высококачественными и количественными способами.[3]
5.2 Высококачественный способ определения фагов E.coli
Чашечку Петри с питательным агаром засевают дневной бульонной культурой пищеварительной палочки газоном и подсушивают при 37 °С в течение 10—15 мин. Потом на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтоб капля стекла к обратному краю. Опосля дневной инкубации в термостате просматривают чашечку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.[3]
5.3 Количественный способ — определение титра фага по способу Грациа
Для постановки опыта за ранее:
а) разливают питательный агар в чашечки Петри, подсушивают в термостате;
б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3 — 4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10-2 — 10-7 зависимо от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Потом 0,5 мл из крайнего разведения фага (10-7) соединяют с таковым же объемом дневной бульонной культуры чувствительных к фагу микробов и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 0С. Смесь стремительно выливают на поверхность агара в чашечке Петри, где она застывает в виде узкого слоя.
Так же готовят смесь из последующего разведения фага (10-6) с микробами и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в иной чашечке, потом — из разведения 10-5. Опосля застывания второго слоя агара чашечки инкубируют при 370 С, потом подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной консистенции. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл начальной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, именуется его титром (табл.1).[3]
Таблица 1. Результаты титрования фага но способу Грациа (форма протокола)
5.4 Определение диапазона литического деяния фага
Чашечку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На любой квадрат петлей наносят каплю соответственной бульонной культуры и распределяют ее по агару в границах данного квадрата. Потом на любой засеянный квадрат петлей либо пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. Опосля дневной инкубации в термостате просматривают чашечку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис микробов либо так именуемые стерильные пятна на бактериальном газоне. количество разных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, описывает широту диапазона его литического деяния.[3]
5.5 Фаготипирование микробов
Испытуемую суточную бульонную культуру микробов засевают на поверхность питательного агара в чашечке Петри, слегка подсушивают в термостате, потом делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле разных типоспецифических фагов. Опосля дневной инкубации отмечают на чашечке те квадраты, в каких имеется сплошной лизис микробов. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 6).[3]
Рис.6. Постановка опыта фаготипирования культуры стафилококка.
5.6 Определение лизогении
Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от микробов. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, крайний будет содержаться в надосадочной воды. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через 1 день инкубации при 37 0С образуются очаги лизиса «стерильные» пятна. При отрицательном итоге опыта исследуемую бактериальную культуру за ранее подвергают УФ — облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Потом поступают так же, как и в прошлом опыте.[3]
6. Практическое применение
Благодаря собственному разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть применены с лечебно — профилактической целью при разных заболеваниях (дизентерия, холера, разные гнойно-воспалительные кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов), вероятна также естественная передача генов меж микробами средством неких фагов (трансдукция). Как правило, таковым нездоровым назначаются лекарства. Но в связи с тем, что повсевременно мутирующие бактерии получают устойчивость к лекарствам, их эффективность за крайние годы ослабела. внимание исследователей завлекли бактериофаги — вирусы, пожирающие бактерии. В отличие от лекарств, которые уничтожают как вредную, так и здоровую микрофлору организма, бактериофаги избирательны, под их действие попадают лишь патогенные бактерии. Как действуют бактериофаги в организме? Они попадают лишь в определенные клеточки и ведут взаимодействие с их ДНК , создавая лизогенный либо литический эффект. Воздействуя на бактерии при литическом типе, бактериофаги уничтожают их, что дозволяет им стремительно плодиться. Лизогенный тип представляет собой проникновение генома фага в геном бактерии, их синтез и предстоящий переход из 1-го поколения в другое. информация о бактериофагах возникла больше века вспять при использовании их для исцеления стафилококка. В истинное время они обширно употребляются для профилактики и исцеления пищеварительных, стафилококковых, стрептококковых, тифозных и почти всех остальных зараз. Современная медицина отыскивает способы, при которых употребляются не живы бактериофаги, а ферменты, воздействующие на патогенные бактерии лизированием. Их применение быть может в виде назального либо орального спрея, зубной пасты, товаров питания, пищевых добавок. Эффективность внедрения бактериофагов состоит в отсутствии противопоказаний и осложнений, сочетаемости с иными лекарствами, активном действии на антибиотико-устойчивые бактерии. Благодаря сиим свойствам, бактериофаги оценены как препараты грядущего для удачной борьбы с инфекциями.
Важными плюсами фаготерапии являются высочайшая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагу, возможность начального внедрения маленьких доз бактериофага, сочетаемость со всеми видами классической одноклеточнае мельчайшие организмы»>бактерицидной
смерти крайней микробной клеточки в очаге заразного поражения он прекращает свою активную деятельность и безо всяких следов выводится из организма.
В связи с наблюдаемым понижением терапевтического деяния лекарств препараты бактериофагов употребляются в медицинской практике как кандидатура лекарствам и в сочетании с крайними. Препараты бактериофагов не уступают бактерицидным продуктам по эффективности, стимулируют местные причины специфичного и неспецифического иммунитета и не вызывают при всем этом побочных токсических и аллергических реакций. Бактериофаги назначают вовнутрь, также употребляют для орошения ран, для введения в дренированные полости — брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря. При пероральном и аэрозольном применении, также при нанесении на поверхность слизистых оболочек бактериофаги попадают в кровь и лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.
В истинное время возобновился энтузиазм к фаготерапии в хирургии, урологии, офтальмологии, травматологии.
Лечебно-профилактические препараты бактериофагов составлены из поликлональных вирулентных бактериофагов широкого спектра деяния, активных и в отношении микробов, устойчивых к лекарствам. Их выпускают в водянистом виде, в пилюлях с кислотоустойчивым покрытием, в виде свеч, мазей, линиментов.
Препараты бактериофагов представляют собой стерильный фильтрат бактериальных фаголизатов, их назначают вовнутрь, местно для орошения ран и слизистых, введения в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, также в дренированные полости — брюшную, плевральную, также в полости абсцессов опосля удаления экссудата.
Бактериофаги способны стремительно просачиваться в тканью. Состоит из плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов) и лимфу и выводятся через почки с мочой. Как показано в наших исследовательских работах, опосля приема 30 мл бактериофага уже через 2 часа фаговые частички обнаруживаются в моче, а наибольшая концентрация их в моче достигается через 6-8 часов опосля приема.
Активность лечебно — профилактических бактериофагов в отношении возбудителей гнойно-септических и энтеральных заболевании довольно высока — от 72 % до 90%, в том числе и в отношении штаммов госпитального происхождения, характеризующихся множественной устойчивостью к лекарствам. Соответствие препаратов бактериофагов современной атиологической структуре возбудителей достигается их неизменной адаптацией к циркулирующим штаммам за счет обновления фаговых рас и производственных бактериальных штампов. Эта изюминка прибыльно различает фаги от остальных антимикробных препаратов — лекарств, эубиотиков либо вакцин, где производственные штаммы либо штаммы-продуценты, либо синтезированное вещество не подлежат любым модификациям. Таковая пластичность бактериофаговых препаратов обеспечивает продолжение первичной фагоустойчивости возбудителей.
Достоинства бактериофаговых препаратов.
К преимуществам бактериофаговых препаратов относятся узенькая специфика деяния, не вызывающая, в отличие от лекарств, подавления обычной микрофлоры. Подтверждено стимулирующее действие стафилококкового бактериофага на бифидобактерии — важный компонент микробиоценоза кишечного тракта. Внедрение бактериофагов для исцеления заразных болезней провоцирует причины специфичного и неспецифического иммунитета, что в особенности отлично для исцеления приобретенных воспалительных болезней на фоне иммунодепрессивных состояний, бактерионосительства.
Экспериментальными работами и продолжительными клиническими наблюдениями подтверждена невозможность передачи плазмид стойкости к лекарствам и токсигенности лечебно-профилактическими продуктами бактериофагов, поэтому что они являются поликлональными комплексами вирулентных бактериофагов.
В Рф, в странах СНГ , призванная регулировать отношения сотрудничества между государствами, ранее входившими в состав СССР), Польше, Франции, Испании бактериофаги обширно употребляются в медицине и ветеринарии. Накоплен большенный опыт использования бактериофагов в снятие или устранение симптомов и заболевания»>лечении болезней, вызванных условно — патогенными микробами, дисбактериозов, гнойных поражений кожи, ЛОР — органов, опорно-двигательного аппарата, мочеполовой системы, систем органов кровообращения и дыхания, в том числе у новорожденных и деток первого года жизни.
Принципиальным условием, обеспечивающим результативность исцеления фаговыми продуктами, является определенная фагочувствительность возбудителя.
Нагляден длительный опыт фаготерапии в НИИ урологии; в итоге адаптации в НПО «Биофаг» коммерческих бактериофагов к госпитальным штаммам, циркулирующим в урологической поликлинике, фагочувствительность штаммов повысилась на 15 % и находилась на уровне и выше чувствительности к самым современным забугорным лекарствам. На фоне долгого использования бактериофагов в стационаре посреди госпитальных штаммов не наблюдалось формирования фагоустойчивости, в то время как резистентность к лекарствам уменьшалась. Клиническая эффективность фаготерапии наблюдалась в 92 % случаев, часто превосходя результаты антибиотикотерапии. Отсутствие противопоказаний и осложнений при применении препаратов бактериофагов, возможность их использования в сочетании с иными фармацевтическими продуктами, в том числе и с антибиотиками, активность в отношении антибиотико — резистентных штаммов и адаптация бактериофагов к современным возбудителям — все это дозволяет оценить препараты бактериофагов как высокоэффективное и перспективное средство критической процесс гнойно — септических и энтеральных зараз. Но фаги, эти «природные санитары», могут быть применены не только лишь для исцеления, да и для профилактики заразных болезней. Их можно назначать беременным, кормящим матерям и детям хоть какого возраста, включая недоношенных. Главным условием их удачного внедрения является проверка выделенной культуры на чувствительность к соответственному фагу. Отмечена умопомрачительная закономерность: в отличие от лекарств, чувствительность клинических штаммов микробов к бактериофагам размеренна и имеет тенденцию к росту, что можно разъяснить обогащением целительных препаратов новенькими расами фагов. Кроме мед внедрения, бактериофаги обширно употребляются в ветеринарии; в особенности эффективен стафилококковый бактериофаг при снятие либо устранение симптомов и работоспособности»>заболевания «>лечении . Состоит из плазмы и форменных частей: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов»> образованная жидкой соединительной тканью. Состоит из плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов»>кровь , лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.
Таковым образом, бактериофаги употребляют:
· в ветеринарии для:
профилактики и исцеления бактериальных болезней птиц и звериных;
исцеления гнойно-воспалительных болезней слизистых глаз, полости рта;
профилактики гнойно-воспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах;
· в генной инженерии:
для трансдукции — естественной передачи генов меж микробами;
как векторы, переносящие участки ДНК ;
при помощи фагов можно конструировать направленные конфигурации в геноме хозяйской ДНК ;
· в пищевой индустрии:
в массовом порядке фагосодержащими средствами уже обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса и домашней птицы;
бактериофаги используют в производстве товаров питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции, и пр.;
· в сельском хозяйстве:
распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от тления и бактериальных болезней;
для защиты скота и птицы от зараз и бактериальных болезней;
· для экологической сохранности:
бактерицидная обработка семян и растений;
чистка помещений пищеперерабатывающих компаний;
санитарная обработка рабочего места и оборудования;
профилактика помещений больниц;
проведение экологических мероприятий.[5,6,8,9,10,11,12]
Заключение
Развитие естествознания необыкновенно расширило представления человека о окружающем его мире. Мир невидимых {живых} созданий — микробов, хранит ещё много загадок, узнать которые весьма принципиально для населения земли.
Вирусология — стремительно развивающаяся ветвь современной биологии. Её теоретическое и практическое жизни человека, звериного и растений. Развитие вирусологии соединено с блестящими фуррорами молекулярной генетики. исследование вирусов привело к осознанию узкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению устройств мутации. Вирусы обширно используются в работах генной инженерии. Способность вирусов адаптироваться, вести себя непредсказуемо — не понимает предела.
Миллионы людей стали жертвами вирусов — возбудителей разных заболеваний. И всё — таки главные успехи вирусологии достигнуты в борьбе с определенными заболеваниями и это даёт основание утверждать, что в нашем 3-ем тысячелетии вирусология займёт ведущее пространство.