Загрузка...
Учебная работа. Влияние атропина на активность карбоксипептидазы H
Исследовано воздействие однократного действия атропина на активность карбоксипептидазы Н и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы — ферментов, участвующих в конечной стадии образования на биологическом уровне активных нейропептидов из предшественников. Наблюдалось долгое, сохраняющееся по последней мере в течение 72 ч понижение активности исследуемых ферментов. Предполагается, что понижение активности исследуемых ферментов быть может одним из устройств понижения уровня нейропептидов при действии больших доз атропина.
Главные слова: карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза, атропин, нейропептиды, обычно расположенный в головном отделе тела и представляющий из себя малогабаритное скопление служащий для передачи в мозг важной для организма информаци»>нервных .
Холинотропные препараты оказывают свое действие фактически на все регуляторные системы. Особенный энтузиазм представляет исследование их взаимодействия с пептидергической системой, так как нейропептиды участвуют в регуляции различных нейрофизиологических действий и соматических функций, в том числе тех, которые нарушаются при отравлении холиноблокаторами [1, 2, 3]. Общепризнано, что первичная фармакологическая реакция центральных холинотропных препаратов связана с активацией либо блокированием холинорецепторов [4]. Но обилие фармакологических эффектов (а именно, транквилизирующее, анальгезирующее воздействие и т.д.) препаратов данной для нас группы тяжело разъяснить лишь с данной для нас позиции. Исследования проявили, что действие этих препаратов на обмен медиаторов (норадреналина, серотонина, дофамина) [5], фосфолипидов и синтез белка [6] не дает способности полностью разъяснить механизм их деяния.
Имеется огромное количество литературных данных о изменении концентрации регуляторных пептидов в расположенный в головном отделе тела«>мозге и сыворотке крови звериных при действии холинолитиков [7, 8]. Но молекулярные механизмы деяния холинотропных препаратов на уровень биологически-активных пептидов не исследованы.
Активная форма регуляторных пептидов появляется в итоге протеолитического процессинга пропептидов. На конечных стадиях этого процесса, в итоге которого образуются на биологическом уровне активные пептиды, участвуют главные карбоксипептидазы, а именно карбоксипептидаза Н (КПН, КФ 3.4.17.10) и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) [9, 10]. КПН локализована в секреторных везикулах и вовлекается в процессинг предшественников почти всех регуляторнгых пептидов [9, 10]. ФМСФ-КП — не так давно описанный фермент [10], субстратная специфика и тканевая локализация которого дозволяет представить возможность его вовлечения в обмен ряда на биологическом уровне активных пептидов, в индивидуальности опиоидных [10]. Но био роль этого фермента почти во всем остается не ясной.
В связи с сиим, целью данной работы было исследование активности КПН и ФМСФ-КП при однократном внедрении атропина в отделах головного мозга и надпочечниках крыс, характеризующихся высочайшим уровнем регуляторных пептидов.
Материалы и способы
Опыты выполнены на самцах белоснежных беспородных крыс массой 200-300 г. Атропин вводили внутрибрюшинно в физрастворе в дозе 2,5 мг/кг. Контрольной группе звериных вводили равное количество физраствора. Крыс декапитировали через 0.5, 4, 24 и 72 ч опосля инъекции, извлекали надпочечники, головной ткани гомогенизировали в 50 мм натрий ацетатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl, рН 5,6, в соотношении 1: 50 (вес: размер). В приобретенном гомогенате определяли активность КПН и ФМСФ-КП флюорометрическим способом L.D. Fricker and S.H. Snyder [11], содержание белка способом Лоури [12].
Активность КПН оценивали по гидролизу дансил-Phe-Ala-Arg при рН 5.6 как ингибируемую высокоспецифичным ингибитором фермента гуанидиноэтилмеркаптоянтарной кислотой (ГЭМЯК) [11], ФМСФ-КП по гидролизу дансил-Phe-Leu-Arg при рН 5.6 как ингибируемую ФМСФ [10]. Бывалые пробы содержали 50 мкл гомогената и 150 мкл 50 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl. В контрольные пробы вносили ГЭМЯК (в случае КПН) и ФМСФ (в случае ФМСФ-КП) в конечной концентрации 1 мкМ и 1 мМ соответственно. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, потом вносили 50 мкл за ранее нагретого до 37oC раствора субстрата (концентрация в пробе 42 мкМ), приготовленного на том же буфере и инкубировали в течении 60 мин при 37oC. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl. Для экстракции продукта реакции (дансил-Phe-Ala в случае КПН и дансил-Phe-Leu в случае ФМСФ-КП) к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, активно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы делили центрифугированием в течение 10 минут при 1000 о/мин.
Флюоресценцию хлороформной фазы определяли на флюориметре ФМЦ_2 при ?ex=360 нм и ?em=530 нм в кювете шириной 1 см. В качестве эталона употребляли 2 мкМ раствор дансил-фенала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль продукта, образовавшегося за 1 минутку инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Приобретенные результаты обрабатывали статистически с внедрением t_критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Внедрении атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало понижение активности КПН в гипофизе через 0,5 и 4 ч опосля инъекции (рис. 1). В обонятельном расположенный в головном отделе тела«>мозге активность исследуемого фермента понижалась через 24 ч на 55% и оставалась сниженной спустя 72 ч опосля введения (на 13%). В четверохолмии найдено понижение активности КПН через 0,5, 24 и 72 ч, при всем этом наибольшее понижение активности фермента (на 55%) наблюдается через 72 ч опосля инъекции. В продолговатом системы животных, обычно расположенный в головном отделе тела и представляющий собой компактное скопление нервных клеток и их отростков) — центральный отдел нервной системы человека и звериных активность КПН была снижена через 4 и 72 ч на 45-50%, тогда как через 0,5 и 24 ч не различалась от контрольной группы. Введение атропина вызывало понижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе во всех исследуемых промежутках времени на 35-40%. В гиппокампе и стриатуме активность КПН через 0,5 ч понижалась на 30-40%, через 4 ч на 40-45% и через 72 ч приблизительно на 30%. В надпочечниках достоверное изменение активности отмечено лишь через 72 ч опосля введения атропина: понижение на 60% по отношению к контролю.
Таковым образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывает долгое, сохраняющееся по последней мере 72 ч понижение активности КПН во всех отделах мозга и надпочечниках крыс.
Результаты исследования воздействия атропина (2,5 мг/кг) на активность фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс представлены на рис. 2. В гипофизе наблюдалось понижение активности ФМСФ-КП через 0,5 ч на 70%, а через 4 ч на 95% по сопоставлению с контрольной группой. В надпочечниках понижение активности исследуемого фермента наблюдалось спустя те же промежутки времени: через 0,5 ч на 35% и на 70% по прошествии 4 ч. В обонятельном человека и животных, расположенный в головном отделе тела) в протяжении всего времени исследования. В гипоталамусе активность фермента понижалась лишь через 72 ч опосля инъекции. В гиппокампе активность ФМСФ-КП понижалась вдвое относительно контроля через 0,5 и 24 ч.
Таковым образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало понижение активности ФМСФ-КП во всех отделах мозга и надпочечниках крыс, не считая продолговатого мозга .
Невзирая на общую тенденцию понижения активности исследуемых ферментов в расположенный в головном отделе тела«>мозге и надпочечниках при внедрении атропина, имеют пространство и некие различия в степени понижения активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов. Так, более существенное понижение активности в гипофизе при действии атропина наблюдалось для ФМСФ-КП — на 75% через 0,5 ч опосля инъекции и на 95% через 4 ч опосля введения, в то время как для КПН отмечено понижение активности только на 30%. большенный диапазон регуляторных пептидов [10, 11]. По-видимому, КПН принадлежит преобладающая роль в процессинге большинства пептидов — тропных гормонов, окситоцина, вазопрессина, атриального натрийуретического пептида, вещества Р и др. [10, 11]. ФМСФ-КП, возможно, участвует в процессинге опиоидных пептидов, синтезирующихся в гипофизе — энкефалинов и ?-эндорфина — уровень которых по данным остальных создателей [5, 7] существенно понижается при внедрении атропина. Понижение активности ФМСФ-КП в наших опытах при внедрении атропина может свидетельствовать о вовлечении данного фермента в большей степени в обмен энкефалинов.
Направляет на себя внимание тот факт, что в надпочечниках более существенное понижение активности отмечено для ФМСФ-КП, в то время как для гипоталамуса и стриатума более выраженные конфигурации активности наблюдались для КПН. Возможно, понижение активности ферментов процессинга регуляторных пептидов быть может одним из устройств понижения уровня энкефалинов и ?-эндорфина при внедрении атропина [5, 7, 13, 14]. Беря во внимание преимущественную локализацию ФМСФ-КП в надпочечниках можно представить, что конкретно тут данный фермент участвует в генезе регуляторных пептидов, в то время как в стриатуме эта роль принадлежит КПН. В гипоталамусе синтез и секреция на биологическом уровне активных пептидов этого отдела (аргинин-вазопрессин, окситоцин и др.) также подвержена воздействию холинергической системы [13, 14]. Существенное понижение активности КПН, участвующей в образовании активных форм этих пептидов из предшественников [9, 10], по всей видимости, обеспечивает понижение уровня аргинин-вазопрессина и окситоцина атропином [7].
Таковым образом, ФМСФ-КП, как и КПН, возможно, принадлежит принципиальная роль в регуляции уровня активных форм нейропептидов при внедрении атропина. При всем этом КПН и ФМСФ-КП, по-видимому, участвуют в процессинге не только лишь различных био пептидов, да и вовлекаются в процессинг одних и тех же нейропептидов в различных отделах нервной системы.
Перечень литературы
1. Судаков С.К. // Успехи совр. биол. 1988. 105., №1. С. 100 — 106.
2. Laubie M., Schmitt H. // J. Pharmacol. 1985. 16., №2. P. 69 — 94.
3. Charpali S. at al. // Brain Res. 1988. 450., №1 — 2. P. 124 — 130.
4. Caulfield M. P, Nigel J.M. // Pharm. Reviews. — 1998. — 50. №2. — P. 279-290.
5. Громов Л.А., Лохвицкая К.Н. // Фармакология и токсикология. — К.: Здоров’я, 1971. Т. 6. — С. 24-26.
6. Елаев Н.Р., Иванова А.И., Крылов С.С. // Докл. АН СССР
The effect of a single atropine administration on the activities of carboxypeptidase H and phenylmethylsulphonilfluoride-inhibited carboxypeptidase part in the final stage of formation of biologically active neuropeptides from precursors was studied. Changes in the enzymes’ activities after administration were evident during at least 72 h. The results suggest that one of possible mechanisms of reduction of neuropeptide levels by atropine is suppression of activity of enzymes taking part in there metabolism — carboxypeptidase H and phenylmethylsulphonilfluoride-inhibited carboxypeptidase.
]]>