Загрузка...
Учебная работа. Биологические свойства энтерококков, выделенных из кишечника детей с разной степенью дисбактериоза
Био характеристики энтерококков, выделенных из кишечного тракта малышей с разной степенью дисбактериоза
Введение
Энтерококки, входящие в состав обычной микрофлоры пищеварительного тракта человека, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых. В то же время они являются представителями группы условно-патогенных микробов, способных вызывать аутоинфекцию, а при накоплении в окружающей среде — приводить к экзогенному инфицированию. Долгое время они рассматривались как достаточно неопасные комменсалы желудочно-кишечного тракта человека и звериных. Но уже наиболее 100 лет вспять возникли 1-ые свидетельства о этиологической роли микробов данной группы в появлении госпитальных зараз у ослабленных пациентов. Кардинальное изменение представления о энтерококках вышло в 1980-е годы, когда был выявлен высочайший уровень стойкости микробов к ампициллину. Возросшее клиническое (Соединённые Штаты Америки — сходу переместили энтерококки в «премьер-лигу» грамположительных патогенов со множественной устойчивостью к лекарствам совместно с метициллинрезистентными Staphylococcus aureus и пенициллинрезистентными Streptococcus pneumoniae. [16]
Современные способы исследования микробов, успехи геномики и протеомики дозволили найти и детально изучить существенное количество детерминант патогенности и антибиотикорезистентности энтерококков.
Но большая часть исследовательских работ по оценки патогенного потенциала энтерококков выполнена на клинических изолятах микробов, выделенных при разных заразных действиях. Данные о частоте встречаемости главных параметров, определяющих патогенность микробов, у культур из естественного места обитания (кишечного тракта) фактически отсутствуют. В связи с сиим, цель данной работы — оценить причины патогенности и чувствительность к лекарствам у энтерококков, выделенных из кишечного тракта малышей с разной степенью дисбактериоза.
Задачки работы:
1. провести высококачественное и количественное исследование испражнений для определения степени дисбактериоза кишечного тракта;
2. идентифицировать выделенные энтерококки до вида;
3. найти продукцию ферментов патогенности: гемолизинов, желатиназы и дезоксирибонуклеазы;
4. изучить адгезивные характеристики энтерококков;
5. найти антибиотикочувствительность выделенных культур;
6. оценить выраженность причин патогенности зависимо от вида энтерококков и степени дисбактериоза.
1. Обзор литературы
1.1 Черта рода Enterococcus
Энтерококки — род грамположительных кокков. Мельчайший организм был описан в первый раз Эшерихом в 1886 г., когда им был выделен кокк из кишечного тракта малыша, нареченный им за его удлиненную форму овальным микрококком. В течение первых 25 лет этот микроорганизм не привлек внимания бактериологов и числился безопасным сапрофитом. Но его нередкое присутствие в качестве сапрофита в организме человека, в особенности в кишечном тракте и мочеполовом тракте, также бесспорная патогенность повели к кропотливому исследованию его параметров. Заглавие энтерококк не сходу утвердилось за сиим микроорганизмом; только в 1889 г. французский ученый Тирселен выделил аналогичного кокка при энтеритах с нагноениями и отдал ему заглавие энтерококка, оставшееся и в истинное время за сиим микроорганизмом. Прямо до 1984 года бактерии рода Enterococcus классифицировались как стрептококки группы D, пока способом геномного анализа ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) не было показано, что наиболее верно выделение их в отдельный род. По современной систематизации род Enterococcus заходит в семейство Enterococcaceae, порядок Lactobacillales, класс Bacilli, тип Firmicutes, королевство Бактерии. Род включает последующие виды: Е. faecalis, Е. faecium, Е. avium, E. pallens, Е. casseliflavus, Е. durans, Е. gallinarum, Е. raffinosus, Е. gilvus, Е. irae, Е. malodoratus и Е. mundtii. В клиническом материале от человека встречаются Е. faecalis, Е. faecium, Е. gilvus, E. durans и E. pallens. [21]
Морфология. Энтерококк слегка удлинен и припоминает по форме пневмококка, но не имеет капсулы и несколько крупнее его размером. Меж 2-мя кокками видна маленькая щель; кокки размещены попарно и маленькими цепочками, время от времени маленькими кучками. Они различаются полиморфизмом и иногда принимают вид диплобактерий, отлично окрашиваются анилиновыми красками и по Граму. Спор не образуют. Энтерококки являются факультативными анаэробами, лучшая температура культивирования которых составляет 35-37 °С. Энтерококки производят метаболизм бродильного типа, ферментируют различные углеводы с образованием в главном молочной кислоты, но не газа, снижая рН до 4,2-4,6. В неких вариантах восстанавливают нитрат, обычно лактозопозитивные. [11]
Экология. Обитают эти бактерии в большей степени в узком кишечном тракте. Но большое их количество находится и в толстом кишечном тракте, также они встречаются в маленьких количествах во рту и в половых органах. У малышей в возрасте до года количество энтерококков в кале составляет до 100 000 000 клеток на 1 г. фекалий. Как неизменные представители микрофлоры кишечного тракта, энтерококки участвуют в усвоении сахаров, синтезе витаминов, ликвидировании патогенных микробов. Энтерококки высокорезистентны к разным факторам наружной среды и антисептическим средствам, могут долгое время сохранять жизнеспособность на предметах домашнего обихода, в течение нескольких месяцев — на обыденных агаровых косяках.
Культуральные характеристики. Энтерококк отлично вырастает на всех обыденных питательных средах при 37 °С, так же и при комнатной t; на агаре дает прозрачные капелькообразные колонии, обычные для стрептококковой группы, величиной в 1-2 мм. Могут давать гамма-гемолиз на кровяном агаре. В бульоне энтерококк постоянно образует равномерную муть; через несколько дней на деньке возникает тянущийся осадок. Энтерококк выдерживает нагревание до 60°, сбраживает маннит, разлагает гликозиды (эскулин, салицин и метил-гликозид), не разлагает раффинозы, не растворяется желчью и стоек в отношении оптохина. Для дифференциальной диагностики энтерококков от стрептококков употребляют аспекты Шермена: рост при 10оС и при 45оС, рост при рН 9,6, рост в среде с 40% желатина, рост в среде с 6,5% NaCl, рост в молоке с 0,1% метиленового голубого, терморезистентность. [18]
Клиническое Энтерококки вызывают последующие поражения мочеполовой системы, эндокардит, остеомиелит, интраабдоминальные инфекции (Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом человека), инфекции (Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом человека) дыхательных путей. В особенности нередко энтерококковые циститы и уретриты имеют пространство у беременных. Германские исследователи находили энтерококки в разных действиях нагноения при аппендиците, парапроктите. Фактически любой 2-ой вариант воспаления желчных путей сопровождался выделением энтерококков в анализах. время от времени эти бактерии могут вызывать плевриты, сепсис и эндокардит. Приобретенные энтериты у малышей также могут быть вызваны микробами рода Enterococcus. Постоперационные гнойные инфекции (Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом человека), также воспалительные заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности), вызванные долговременной катетеризацией мочевыводящих путей, часто вызываются энтерококками в ассоциациях с иными патогенными микробами. Встречались даже отдельные случаи, когда энтерококки были выделены в качестве единственного источника инфецирования. Энтерококки вызывают пищевые отравления и пищеварительные дисбактериозы. Хотя, видимо, не постоянно и лишь у тех людей, которые имеют ослабленную иммунную систему. Ведь в сыр сорта «Чеддер» для улучшения вкуса добавляют культуру энтерококков. До сего времени как бы не было массовых случаев острых пищевых отравлений сиим видом сыров. [10]
состояние иммунной системы играет важную роль в профилактике и снятие либо устранение симптомов и лечении (процесс для облегчение, снятие или устранение симптомов и работоспособности»>заболевания) болезней, вызываемых энтерококками. И в данной связи хотелось бы отметить таковой немалозначимый нюанс, как микрофлора желудочно-кишечного тракта. Баланс лакто- и бифидобактерий, которые сосуществуют в норме с энтерококками и регулируют их численность, быть может нарушен. Содействуют этому явлению разные стрессовые причины и работоспособности»>исцеление антибиотиками может вызвать суровые дисбактериозы, в каких учавствуют как разные энтеробактерии, так и энтерококки. Потому в составе всеохватывающего исцеления и для профилактики схожих явлений нужно восстанавливать баланс микробов в организме. [14]
Внедрение в индустрии. Энтерококки являются активным ингредиентом неких фармацевтических средств-пробиотиков, созданных для исцеления дисбактериоза и восстановления обычной микрофлоры кишечного тракта. А именно, в фармацевтические препараты-пробиотики Бифиформ, (Компанияизготовитель Ferrosan) Линекс (изготовитель Lek) и Bioflorin (изготовитель Cerbios-Pharma) включён специально подобранный, отличающийся высочайшим уровнем антибиотикорезистентности и непатогенности штамм Enterococcus faecium SF68, в геноме которого отсутствуют известные для патогенных клинических изолятов энтерококков гены вирулентности. Беззародышевый аква субстрат товаров обмена веществ Enterococcus faecium DSM 4086 заходит в состав противодиарейного лекарства Хилак форте.
Для включения в пробиотики обычно употребляют штаммы энтерококков, начально селекционированные для сотворения пищевых товаров. Эти штаммы не адаптированы к долговременному пребыванию в организме человека и за одну-две недельки вполне выводятся из него. СанПиН 2.3.2.2340-08, утвержденный Постановлением Головного муниципального санитарного доктора РФ (Российская Федерация — температуры является их способность отлично подавлять болезнетворные бактерии в самих пищевых продуктах. Незначимое содержание энтерококков в колбасах, сырах и мясном фарше не дозволяет плодиться в пищевых продуктах таковым микробам, как стафилококки, листерии и пищеварительные палочки. Основная причина антагонистической активности энтерококков — их способность продуцировать недлинные пептиды — энтероцины. Данные пептиды, которые почаще всего относятся к педиоциноподобным бактериоцинам второго класса, способны при контакте с бактерией вызывать повреждение клеточной стены с следующей смертью клеточки. [10]
Таковым образом, энтерококки играют разноплановую роль в жизни человека. Эти мельчайшие организмы обширно всераспространены в природе. Они являются представителями резидентной обычной микрофлоры человека и звериных, встречаются в пищевых продуктах, воде, растениях, у звериных, птиц и насекомых. Некие штаммы данных микробов, приобретя ряд признаков патогенности, могут вызывать суровые заразные человека, от энтерококков патогенных является наличие либо отсутствие у штамма энтерококков набора генов патогенности.
1.2 Причины патогенности энтерококков
В истинное время мельчайшие организмы рода Enterococcus занимают фаворитные позиции в качестве предпосылки нозокомиальных и оппортунистических зараз. Так, при послеоперационных осложнениях из брюшной полости Enterococcus spp. Выделяют в 15% случаев, и они стоят на втором месте по частоте встречаемости. Подобные данные получены и исследователями в Саудовской Аравии, где при нозокомиальных инфекциях энтерококки выделяют в 25% случаев. На местности Стране восходящего солнца посреди грамположительных аэробных микробов энтерококки стоят на первом месте по частоте встречаемости при хирургических инфекциях. Ведущим этиологическим фактором при инфекциях мочевыводящих путей и приобретенном бактериальном простатите также являются энтерококки. Возникающая опосля гемодиализа бактериемия в 30% случаев вызвана энтерококками. Данные русских создателей подтверждают эту тенденцию. [9]
Способность энтерококков вызывать заразный процесс обоснована наличием у неких штаммов широкого диапазона причин вирулентности:
· причины адгезии и колонизации: адгезин Еsp, адгезин Asa, фактор агрегации, адгезин EfaA, сенсор коллагена;
· причины пенетрации и повреждения тканей: желатиназа, сериновая протеиназа, гиалуронидаза, Fsr-регулятор;
· причины гемолиза, токсигенности, бактериоциногенности: гемолизины, бактериоцины и феромоны;
· устойчивость к лекарствам и микробицидным факторам организма (устойчивость к желчным кислотам). [4]
При всем этом недозволено не отметить, что почти все из так именуемых причин патогенности энтерококков являются необходимыми компонентами их функционирования, обеспечивающими их существование в характерной им экосистеме, и не соединены впрямую с повреждением тканей владельца либо угнетением системы иммунитета. Так, адгезины актуально нужны для обычной колонизации в желудочно-кишечном тракте, а гидролаза желчных кислот увеличивает их шансы выжить в двенадцатиперстной кишке. Детализированный молекулярно-генетический анализ вирулентных штаммов энтерококков показал, что большая часть генов вирулентности локализовано довольно компактно на геноме данных штаммов. В истинное время довольно отлично установлено, что участки генома с генами вирулентности являются мобильными элементами и могут передаваться от 1-го штамма другому. Данные генетические элементы, именуемые «островами» патогенности, могут содержать разный набор генов вирулентности, включая гены стойкости к лекарствам. [5]
1.3 Причины адгезии и колонизации
Адгезия является пусковым механизмом заразного процесса. Под адгезией соображают способность мельчайшего организма адсорбироваться на чувствительных клеточках с следующей колонизацией. Структуры, ответственные за связывание мельчайшего организма с клеточкой именуются адгезинами и размещаются они на его поверхности. Адгезины весьма многообразны по строению и обусловливают высшую специфика — способность одних микробов прикрепляться к клеточкам поверхность (эпидермис) и полости тела, а также слизистые оболочки внутренних органов, пищевого тракта, дыхательной системы, мочеполовые пути) лат. epithelium дыхательных путей, остальных — пищеварительного тракта либо мочеполовой системы и т.д. На процесс адгезии могут влиять физико-химические механизмы, связанные с гидрофобностью микробных клеток, суммой энергии притяжения и отталкивания. У энтерококков адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стены.
Кроме адгезинов у энтерококков выделяют еще субстанцию агрегации. Это поверхностный белок, опосредующий агрегацию микробов в процессе конъюгации. В процессе зараз этот фактор обеспечивает конкретное токсическое действие на ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) миокарда и легких. Субстанция агрегации, как правило, выявляется у штаммов, продуцирующих цитолизин. Возможно, меж обозначенными факторами проявляется синергизм. [21]
Одним из причин реализации колонизационной резистентности кишечного тракта является адгезия представителей индигенной микрофлоры. Владея массивным адгезивным потенциалом, представители нормофлоры, колонизируя экониши естественного обитания, препятствуют адгезии патогенных микробов. Но при диcбиотических нарушениях микробиоценозного гомеостаза происходит почаще всего повышение численности представителей аэробной части микрофлоры и усиление брутального потенциала этих микробов, что содействует преодолению ими барьера приэпителиального слоя кишечного тракта и транслокацию во внутреннюю среду организма. В этом случае адгезивные характеристики микробов выступают в роли фактора патогенности. Наибольшее
1.4 Ферменты злости энтерококков
Микробные ферменты содействуют инвазии микробов и помогают им противостоять защитным реакциям организма.
Желатиназа — фермент, гидролизует желатин, коллаген, гемоглобин и некие остальные низкомолекулярные пептиды. Является продуктом гена gelE.
Геалуронидаза — катализирует реакции гидролитического расщепления и деполимеризации гиалуроновой кислоты и тем содействует увеличению проницаемости тканей. Продукт гена cyl.
Супероксиддисмутаза — фермент, локализованный в цитоплазме. Обеспечивает высшую устойчивость к O2.
Сериновая протеиназа — относится к группе эндопептидаз, имеющих в каталитическом центре остаток серина. Способна «разрезать» белки рассечением пептидных связей. Продукт гена spr. [5]
Цитолизин — цитолитический (а именно, гемолитический) токсин (яд биологического происхождения) белковой природы, владеющий также качествами бактериоцина. Цитолизин с высочайшей частотой обнаруживают у штаммов E. faecalis, выделяемых при инфекциях различной локализации.
У энтерококков выделяют 2 класса бактериоцинов: I — цитолизин и II — энтероцины и мундтицины. I класс присущ патогенным видам энтерококков. Непатогенные E. faecalis и остальные виды Enterococcus, выделенные от здоровых людей и звериных, также из пробиотических и пищевых товаров, секретируют, как правило, бактериоцины класса II. Конкретно эти нетоксигенные антимикробные пептиды представляют наибольший мед Энтузиазм. [9]
Цитолизин (гемолизин) — представляет собой дипептид, состоящий из 2-ух субъединиц — CylL и CylS с молекулярными массами 3,4 и 2,0 кДа соответственно. Лишь штаммы, способные синтезировать обе субъединицы, владеют гемолитической активностью. Он может разрушать людские, бараньи и лошадиные эритроциты, полиморфноядерные лейкоциты, эпителиоциты кишечного тракта и клеточки сетчатки глаза человека.
Генетический локус, обеспечивающий продукцию цитолизина, находится в высокотрансмиссивной плазмиде pAD1 (58 кБ), содержащей гены, кодирующие субъединицы бактериоцина и пептид Cyl A, который нужен для их внеклеточной активации. Не считая того, огромное синтез регуляторных белков. Синтез цитолизина происходит в виде 2-ух субъединиц пептидной природы, фаворитные части (N-части) которых распознаются «транспортными» АТФ-азами АВС-типа и регулируются двухкомпонентной регуляторной системой под контролем 2-ух регуляторных белков (CylR2 и CylR1).
Цитолизин энтерококков владеет способностью создавать поры в цитоплазматической мембране грамположительных микробов: Listeria monocytogenes, Pediococcus spp. и Lactococcus spp. [6]
Одним из критериев оценки вирулентности энтерококков является устойчивость к лекарствам. Энтерококки имеют широкий диапазон природной стойкости к бактерицидным продуктам различных классов, таковых как цефалоспорины, пенициллины, устойчивые к действию пенициллаз (оксациллин), аминогликозиды (низкие концентрации), хинолоны и линкозамиды. Естественная устойчивость не передается горизонтально, риск ее передачи к патогенным микробам отсутствует.
Энтерококки способны получать устойчивость к бактерицидным продуктам методом переноса плазмид, транспозонов, хромосомным обменом либо вследствие мутаций. Обретенная устойчивость к большинству лекарств, совместно с природной устойчивостью и устойчивостью к факторам окружающей среды, позволило энтерококкам отлично приспособиться к существованию и распространению в больничных критериях. [8]
Гликопептидные лекарства (ванкомицин) обычно употребляются при страны, такие как Англия, были наименее задеты эпидемией VRE, а Сингапур в 2005 году приостановил ее. VRE поддается исцелению композицией лекарств хинупристин / далфопристин (Synercid, в Рф не зарегистрирован), с чувствительностью около 70%. [13]
Бензилпенициллин и ампициллин в концентрациях, создаваемых в крови (внутренней средой организма человека и животных) и остальных тканях, фактически не оказывают антибактериального деяния на энтерококков. При томных энтерококковых инфекциях рекомендуется соединять какой-нибудь из этих препаратов с аминогликозидом, так как in vitro эта композиция владеет синергичным антибактериальным действием. Ампициллин добивается довольно больших концентраций в моче, потому его употребляют для монотерапии неосложненных зараз мочевых путей. При других энтерококковых инфекциях к нему добавляют гентамицин (при обычной функции почек — 1 мг/кг любые 8 ч). При аллергии к пенициллинам ампициллин подменяют ванкомицином, назначая его также в сочетании с аминогликозидом. Цефалоспорины в отношении энтерококков неактивны. При томных энтерококковых инфекциях определяют чувствительность возбудителя и на ее основании выбирают схему антимикробной для снятия либо устранения симптомов и проявлений работоспособности»>заболевания
(нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности)«>терапии ( оздоровление»>терапия — процесс, для снятия или устранения симптомов и проявлений инфекции (Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом человека) не употребляют. Всераспространена посреди энтерококков и устойчивость к гентамицину (МПК наиболее 2000 мкг/мл). Но устойчивые к гентамицину штаммы могут оказаться чувствительными к остальным аминогликозидам, в том числе к стрептомицину. Если возбудитель устойчив ко всем аминогликозидам, может оказаться удачной монотсрапия бензилпенициллином либо ампициллином. [7]
2. Дисбактериоз кишечного тракта
организм человека и колонизирующие его органы и ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология) бактерии представляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии динамического равновесия. Видовой состав и количественные соотношения микробов в норме относительно размеренны и охарактеризовывают микробиологический статус организма, именуемый также эубиозом. Более заселенным автохтонной флорой является пищеварительный тракт. Его экологический гомеостаз обеспечивается целым рядом защитно-приспособительных устройств: иммунологических (секреторный IgA; комплемент; интерфероны; лизоцим; трансферрин; лактоферрин и др.), механических (обновляющийся любые 6-8 дней дыхательной системы, макро- и микроворсинки с гликокаликсом, перистальтические движения, илеоцекальный канал), хим (слюна, желудочный, панкреотический и пищеварительный сок, желчь, жирные кислоты), био (пищеварительная микрофлора). [19]
Обычная микрофлора желудочно-кишечного тракта, по существу, является первичной мишенью приложения хоть какого попадающего с едой либо водой соединения, первым метаболическим органом, который вовлекается в адсорбцию, трансформацию и / либо перенос естественных и чужеродных субстанций, нужных и потенциально вредных агентов. В ряде всевозможных случаев такие агенты прямо либо косвенно влияют на формирование и функционирование биопленки, выстилающей слизистые желудочно-кишечного тракта и содержащие бессчетные ассоциации микробов. Если по собственной интенсивности такое воздействие превосходит компенсаторные способности экологической системы «макроорганизм его обычная микрофлора», то появляются микробиологические (дисбиотические) нарушения, которые часто служат пусковым механизмом развития, а в следующем и поддержания разных патологических состояний. Дисбиотические нарушения в пищеварительном тракте появляются конфигурацией абсолютного числа анаэробных и аэробных микробов, их видового и штаммового состава, ареала обитания микробов, диапазона и количества образуемых метаболитов и иными признаками. Реакции органов и тканей владельца на дисбиотические конфигурации многообразны по времени появления и степени выраженности, что зависит от направления сдвигов в микрофлоре, глубины отличия от состояния равновесия и наличия критерий для возврата в начальное состояние. При всем этом диапазон клинических проявлений дисбиоза пищеварительного тракта довольно широкий (диареи, запоры, колиты, язвенная болезнь, гиперхолестерининемия, мочекаменная болезнь, кариес, эндо- и суперинфекции разной локализации, разные аллергические проявления и т.д.) и имеет тенденцию к расширению.
понятие дисбактериоза кишечного тракта. Термин дисбактериоз, в первый раз предложенный в 1916 г. A. Nissle, обозначает высококачественные и количественные конфигурации состава микрофлоры и соотношений меж отдельными видами микробов, обусловленные динамическим нарушением микроэкологии кишечного тракта в итоге срыва адаптационных, защитных и компенсаторных устройств и сопровождающиеся клинических проявлений. [1]
В крайнее время в связи с неблагоприятной социально-экономической и экологической обстановкой, гипо- и авитоминозами, нерациональной антибиотико-, гормоно- и химиотерапией, нарушением питания наблюдается повсеместное распространение дисбиотических проявлений эубиоценоза полости рта, кожи, кишечного тракта, влагалища. С целью диагностики дисбактериоза кишечного тракта почаще всего изучат микрофлору толстого кишечного тракта.
Значимым моментом, осложняющим исследование на дисбактериоз, является отсутствие одного, обычного методологического подхода в бактериальной диагностике.
Более нередко проводимое исследование дозволяет, методом нескольких десятикратных разведений кала и высева их на особые среды, определять количественное содержание в биоматериале энтеробактерий, лактобактерий, бифидобактерий, клостридий, энтерококков, стафилококков, грибов; в неких лабораториях список изолируемых микробов в крайние годы расширился, за счет определения в биоматериале бактероидов и анаэробных пептококков и пептострептококков. Невзирая на известные недочеты, этот способ дозволяет выявить отклонение в составе микрофлоры толстого кишечного тракта в сопоставлении с усредненными нормальными показателями, установленными для данного способа. Так как до реального времени нет конкретного представления, какие конфигурации в микрофлоре толстого кишечного тракта являются адаптивными, а какие выходят за границы физиологической нормы, различия в анаэробном компоненте в границах 1-го-двух lg и в аэробном- в границах двух-четырех lg, принято считать физиологическими колебаниями.
Микрофлора толстой кишки здорового малыша представлена 3-мя группами бактерий [приложение 1, Таблица 1]:
1. Основная микрофлора: анаэробная флора, составляющая 95-99% биоценоза (бифидобактерии, бактероиды), она производит главные физиологические функции.
2. Сопутствующая: лактобактерии и обычные штаммы пищеварительной палочки, которые также участвуют в защитной и пищеварительной функциях.
3. Остаточная: аэробная сапрофитная и условно-патогенная флора, которая составляет не наиболее 1% биоценоза (энтерококки, энтеробактерии, стафилококки, протей, дрожжи и т.д.).
Показания к проведению исследования.
Прямыми показаниями к исследованию на дисбактериоз кишечного тракта являются:
· затянувшийся период реконвалесценции опосля дизентерии либо остальных острых пищеварительных болезней;
· продолжительно протекающие пищеварительные расстройства (нефункциональности), при которых не удается выделить патогенные мельчайшие организмы;
· нефункциональность кишечного тракта у лиц, продолжительно подвергающихся действию неких производительных вредностей (ионизирующие излучения, ядовитые хим соединения и др.), также при интенсивной антибиотико- либо иммуносупрессивной терапия от греч. [therapeia] — лечение, оздоровление) — процесс;
· обострения приобретенных болезней желудочно-кишечного тракта (колиты, холециститы, язвенная болезнь и др.);
· наличие системной воспалительной реакции и бактериемии без выраженного очага воспаления;
· наличие тяжело поддающихся исцелению гнойно-воспалительных очагов и вялотекущих заразных действий;
· подготовка к оперативному вмешательству на органах пищеварения;
· нефункциональность кишечного тракта у новорожденных.
Существует несколько классификаций дисбактериоза кишечного тракта, применяемых как клиницистами, так и микробиологами. Более нередко употребляемые систематизации дисбиоза основаны на определении предпосылки, степени нарушений состава микрофлоры, ее вида и нрава нарушения пищеварения.
систематизация из-за:
1) первичный (у фактически здоровых лиц, если причину найти не удалось);
2) возрастной дисбиоз (развивается в связи с закономерными возрастными переменами в главных органах и системах организма);
3) сезонный дисбиоз (вызван сезонными переменами нрава питания и параметров организма);
4) пищевой дисбактериоз (вызван резким конфигурацией нрава питания, к примеру, при диарее путников);
5) проф (в итоге действия проф вредностей);
6) дисбактериоз у болеющих (вторичный — его предпосылкой нередко является другое работоспособности):
— дисбактериоз при заболеваниях пищеварительного тракта;
— заболеваниях печени, при гельминтозах, заразных, паразитических заболеваниях, новообразованиях;
— медикаментозный дисбактериоз;
— дисбактериоз вследствие действия радиоактивных веществ;
7) смешанный дисбактериоз (комплекс различных обстоятельств).
Клиническая систематизация.
Докторы употребляют клиническую систематизацию, которая помогает избрать лучшую стратегию исцеления. Клиническая систематизация дисбактериоза кишечного тракта основывается на выделении вида дисбактериоза зависимо от возбудителя, степени компенсации дисбактериоза, его клинических форм.
Вид дисбактериоза по возбудителю:
1) стафилококковый;
2) протейный;
3) дрожжевой;
4) ассоциированный (стафилококковый, протейный, дрожжевой).
По степени компенсации:
1) возмещенная — клинических проявлений может не быть;
2) субкомпенсированная — возникновение локального воспалительного процесса;
3) декомпенсированная — приспособительные механизмы истощены, вылечить дисбактериоз тяжело. [17]
Согласно нормам ОСТ 91500.11.0004-2003 условно выделяют три степени дисбактериоза [приложение 1, Таблица 2]:
1) I степень (латентная, возмещенная форма) характеризуется незначимыми переменами в аэробной части микробиоценоза, касающимися уменьшения либо роста количества пищеварительной палочки с обычной ферментативной активностью, удельного веса кокковой флоры, и некого понижения полного количества анаэробной флоры до нижних значений нормы. Пищеварительные нефункциональности, как правило, не регистрируются.
2) II степень (субкомпенсированная форма) сопровождается понижением концентрации главных представителей анаэробной флоры и количественными и высококачественными переменами колибактериальной флоры, включая увеличение уровня условно-патогенных микробов. Эта форма дисбактериоза охарактеризовывает пограничное состояние, потому обследуемого можно отнести к группе «риска». Если обозначенные конфигурации микрофлоры выявлены на фоне исцеления бактерийными продуктами, то можно мыслить о начавшейся нормализации микробиоценоза кишечного тракта. Целенаправлено продолжить снятие либо устранение симптомов и проявлений того либо другого работоспособности»>заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности)«>исцеление бактерийными продуктами до восстановления обычной флоры даже в случае отсутствия очевидных клинических проявлений и дисфункций кишечного тракта.
3) III степень характеризуется значимым понижением количества либо отсутствием облигатных анаэробов, резким высококачественным и количественным конфигурацией пищеварительной палочки и соотношений в составе аэробной микрофлоры, численным приемуществом условно-патогенных энтеробактерий, псевдомонад, дрожжеподобных грибов, стафилококков и их ассоциаций, что, как правило, сопровождается пищеварительными нефункциональностями и, часто, деструктивными переменами пищеварительной стены. При таковых состояниях нужным является немедленное предназначение бактерийных преператов и остальных средств для восстановления обычной микрофлоры.
Дисбактериоз является неотъемлемой частью почти всех болезней, сопровождающихся понижением общей либо местной иммунологической реактивности. Но возникающие при дисбактериозе нарушения действий пищеварения и всасывания в узкой кишке, усиление газообразования и моторики кишечного тракта могут проявляться упрямыми диспепсическими расстройствами. О нарушениях действий пищеварения и всасывания можно судить по такому показателю, как масса тела малыша. Потому диагноз (медицинское заключение об имеющемся заболевании) дисбактериоза правомочен. У малышей с дисбактериозом отмечается неспешное восстановление массы тела, нехорошая надбавка на первом месяце жизни. Болезнь имеет долгое, затяжное течение, у большинства малышей развивается гипотрофия, быть может анемия, рахит, отмечается повышение печени. [18]
3. Собственные исследования
3.1 Материалы и способы исследовательских работ
Исследования проводили на базе микробиологической лаборатории МБУЗ ДГКБ №8 г. Челябинска в период с ноября 2012 по март 2013 года. Всего было обследовано 110 малышей в возрасте от 1 года до 5 лет (средний возраст 3 года 10 мес.).
1.1. Материалом для исследования служил кал опосля естественной дефекации, который собирали в стерильный герметичный контейнер с широким горлышком и плотно закрывающейся крышкой, без консерванта. Материал брали из средней порции кала стеклянной либо древесной палочкой в количестве не наименее 2 г. Доставляли кал в лабораторию в наиблежайшие сроки, не позже, чем через 2 часа опосля взятия пробы.
исследование кала проводили в согласовании с МУК №10.05.044.03 [1].
Опосля взвешивания 1 г нативного кала его гомогенизировали в 9 мл физиологического раствора, получая начальное разведение материала (10-1). Потом готовили 100-кратные разведения материала в физиологическом растворе: 10-3, 10-5, 10-7 и 10-9. Из разведений делали дозированные посевы на питательные среды для культивирования разных групп микробов [приложение 2, Схема 1]. Посевы инкубировали при 37оС 24-48 часов; чашечки со средой Сабуро оставляли опосля этого еще на 2 суток при комнатной температуре. Для культивирования анаэробов употребляли анаэростаты; посевы инкубировали не наименее 2-х суток. [1]
Для оценки степени дисбактериоза отменно и количественно учитывали результаты посева согласно нормам ОСТ 91500.11.0004-2003 [3] [приложение 1, Таблица 1, Таблица 2].
1.2. Энтерококки выделяли на кровяном агаре при посеве испражнений по способу Lindsey [приложение 3, Схема 2]. Количество энтерококков учитывали по таблице [приложение 3, Таблица 3].
Для идентификации энтерококков употребляли последующие биохимические испытания:
1. расщепление эскулина (употребляется уплотненная питательная среда с добавлением солей железа, которые при расщеплении эскулина на виноградовый сахар и эскулетин вступают с крайним в соединения, окрашенные в темный цвет);
2. рост в 6,5% солевом бульоне;
3. ферментация маннита;
4. ферментация сорбита;
5. цвет культуры при посеве на Энтерококкагар (ФГУП ГНЦПМ, Оболенск).
По приобретенным результатам биохимических тестов идентифицировали энтерококков до вида [приложение 4, Таблица 4].
Гемолитическую активность определяли посевом культуры «пятачком» на 5% кровяной агар. Инкубировали при 37оС 24 часа, определяли поперечник зоны гемолиза.
Продукцию желатиназы оценивали при помощи 3% желатина: в пробирку со столбиком желатина уколом вносили культуру и инкубировали при 37оС 24 часа. При положительной реакции происходило разжижение желатина.
Для определения фермента дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) проводили посев исследуемых культур энтерококков в виде «бляшек» на DNAse TEST AGAR (Manufactured by Hispanlab, S.A., Madrid). Посевы инкубировали при 37оС 24 часа, оценивали наличие зоны просветления вокруг «бляшки».
Адгезивную способность энтерококков изучали согласно методике В.И. Брилиса. [12] Смесь эритроцитов человека 0 (І) группы крови (внутренней средой организма человека и животных) Rh+ и одномиллиардной суспензии энтерококков инкубировали при 37оС в течение 30 минут, часто встряхивая смесь. Опосля этого готовили мазок, высушивали, фиксировали и окрашивали синькой. исследование адгезии проводили под световым микроскопом, подсчет вели на 25 эритроцитах, беря во внимание не наиболее 5 эритроцитов в одном поле зрения. При оценке адгезивных параметров употребляли последующие характеристики:
· СПА (средний показатель адгезии) — среднее количество микробных клеток прикрепленных к одному эритроциту;
· К (коэффициент адгезии) — количество эритроцитов из 100, принимавших роль в адгезии;
· ИАМ (индекс адгезивности микробов) — отношение среднего количества микробных клеток расположенных на одном эритроците к величине коэффициента адгезии в пересчете на 100.
Мельчайшие организмы считают неадгезивными при ИАМ?1,75; низкоадгезивными — от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными — от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными — ?4,0.
АБ чувствительность определяли диско-диффузионным способом. Культуры разводили по эталону мутности 0,5 McFarland и наносили на Мюллер-Хинтон агар. Употребляли диски с антибиотиками в согласовании с МУК 4.2.1890-04 [2] [приложение 5, Таблица 5].
Обработку приобретенных результатов проводили способами статистической обработки программки Microsoft Excel.
3.2 Результаты собственных исследовательских работ
1) При оценке высококачественного и количественного соотношения микробов было выявлено 3 степени дисбактериоза кишечного тракта [приложение 6, Диаграмма 1]:
· 1 степень — 28 малышей (32,9%);
· 2 степень — 27 малышей (31,8%);
· 3 степень — 30 малышей (35,3%).
2) Энтерококки были выделены от 90 малышей. Таковым образом, частота выделения энтерококков составила 81,8%.
3) Из выделенных культур энтерококков (n=90):
· 74 культуры были идентифицированы как E. faecalis (82,2%);
· 11 культур — как E. faecium (12,2%);
· 5 культур — как E. durans (5,6%) [приложение 6, Диаграмма 2].
4) Гемолизины были выявлены у 17 культур энтерококков, что составило 18,9%. Из их E. faecalis — 15 культур (88,2%), E. faecium — 2 культуры (11,8%). Культуры E. durans гемолитической активностью не владели [приложение 7, Диаграмма 3].
5) Продукция желатиназы была найдена у 8 культур энтерококков, из их E. faecalis — 7 культур (87,5%), E. faecium — 1 приложение 7, Диаграмма 4].
6) Фермент ДНКаза был найден у 3 культур E. faecalis. Другие виды данным ферментом не владели [приложение 7, Диаграмма 5].
7) 2 культуры E. faecalis владели мгновенно и гемолизинами, и желатиназой.
8) Адгезивная способность энтерококков представлена в таблице [приложение 8, Таблица 6].
Энтерококки видов E. faecalis и E. faecium являются высокоадгезивными (ИАМ=6,77±0,42 и 4,8±0,36 соответственно). E. durans были среднеадгезивными (ИАМ=3,45±0,29).
Различия характеристик ИАМ E. faecalis и E. durans статистически достоверны (p<0,001).
9) Все выделенные культуры энтерококков были чувствительны к ванкомицину [приложение 9, Диаграмма 6].
E. durans также показал 100% чувствительность к ампициллину и доксициклину [приложение 12, Диаграмма 9]. Приблизительно половина штаммов E. faecalis и E. faecium оказались резистентными к эритромицину (41,9% и 54,5% резистентных культур соответственно) [Приложения 10-11, Диаграммы 7-8]. Также для всех 3-х видов типично наличие резистентности к аминогликозидам (гентамицин): 20-36,4% резистентных культур.
10) Выраженность причин патогенности зависимо от степени дисбактериоза [приложение 13, Таблица 7]:
1 степень. Почаще всего выделялся вид E. faecalis (86,2%). E. faecium и E.durans выделялись в 6,9% вариантах любой. Гемолитическую активность энтерококки проявляли в 17,2% случаев. Желатиназную — в 10,3%, ДНКазную — 3,4%. Большая часть энтерококков (85,3%) были со средней адгезивной активностью — ИАМ 3,6±0,32.
2 степень. Почаще выделялся вид E. faecalis (82,8%), E. faecium — в 13,8% случаев и E.durans выделялся с частотой 3,4%. Гемолитическую активность энтерококки проявляли в 20,7% случаев. Желатиназную — в 6,9%, ДНКазную — 3,4%. Большая часть энтерококков (96,6%) были со средней адгезивной активностью — ИАМ 3,95±0,35.
3 степень. E. faecalis выделялся с частотой 78,1%, E. faecium — 15,6% и E.durans — 6,3%. Гемолизинами владели 18,8% культур, желатиназой — 9,4%, ДНКазой — 3,1% культур. 93,8% энтерококков владели высочайшей адгезивной активностью — ИАМ 6,5±0,41.
Заключение
В крайнее время резко возросла значимость энтерококков как возбудителей зараз. Невзирая на маленькое количество причин патогенности, энтерококки без своевременного исцеления могут наносить большенный ущерб организму, прямо до смертельного финала. Большая часть энтерококковых зараз носит эндогенный нрав, другими словами при неблагоприятных для макроорганизма критериях энтерококк, входящий в нормальную микрофлору человека, может навредить собственному «владельцу».
Проведя исследования по оценке патогенности энтерококков, выделенных из естественных экологических ниш (кишечного тракта), мы обосновали, что частота встречаемости причин патогенности у клинически незначимых изолятов весьма мала, по сопоставлению с клинически важными. Но тем не наименее, они имеют пространство быть, и в определенные моменты, когда иммунитет человека слабеет, энтерококки, заселяющие естественные экониши, методом реализации собственного патогенетического материала могут послужить источниками эндогенных зараз.
Перечень источников
1. Методические указания МУК №10.05.044.03. Бактериологическая другими словами заключения о сути заболевания и состоянии пациента»>диагностика (процесс установления диагноза, то есть заключения о сущности болезни и состоянии пациента) дисбактериоза кишечного тракта — Астана, 2004. — 35 с.
2. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микробов к бактерицидным продуктам — Москва, 2004.
3. Отраслевой эталон 91500.11.0004-2003. протокол ведения нездоровых. Дисбактериоз кишечного тракта — Москва, 2003.
4. Бондаренко В.М. Симбиотические энтерококки и трудности энтерококковой оппортунистической инфекции (Термин означает различные виды взаимодействия чужеродных микроорганизмов с организмом человека) — М., 2007. — 30 с.
5. Валышев А.В. Причины патогенности энтерококков пищеварительной микрофлоры человека // Жур. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2012. — №4. — Стр. 41-43.
6. Валышева И.В. Генетическая черта вирулентного потенциала энтерококков пищеварительной микробиоты человека // Жур. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2012. — №4. — Стр. 44-47.
7. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: трудности и перспективы использования (обзор литературы) // Вестник Санкт-Петербургского Института. — 2009. — Сер.11. — Вып.3. — Стр. 78-93.
8. Сидоренко С.В. Клиническое человека: современные способности ее поддержания и восстановления // К.: «Эксперт ЛТД». — 2005. — 361 с.
12. Chenoweth C. The epidemiology of Enterococcus // Eur. J. Gin. Microbiol. — 2005. — №9. — Р. 80-89.
13. Franz C. Enterococci in foods — a conundrum for food safety // Int. J. Food Microbiol. — 2003. — Vol. 88. — P. 105-122.
14. Murray B.E. The life and times of the Enterococcus // J. Clin. Microbiol. — 1990. — №3. — Р. 46-65.
15. Sigrun R. Structure and DNA-binding properties of the cytolysin regulator CylR2 from Enterococcus faecalis // The EMBO J. — 2004. — №18. — P. 3632-3642.
кишечный тракт дисбактериоз патогенность энтерококк
]]>