Учебная работа. Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Учебная работа. Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Введение

В крайние годы в качестве кандидатуры радионуклидам в иммуноанализе отыскали обширное применение неизотопные метки, в том числе ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры и коллоидные частички. Применение неизотопных маркеров затрудняется необходимостью синтезировать, очищать и характеризовать белковые конъюгаты в случае всякого определяемого вещества. Ранее система авидин — биотин отыскала обширное применение при локализации, обнаружении и чистке белков. Оказалось, что эта система не наименее полезна и в иммуноанализе.

В работе детально рассмотрены два подхода, при помощи которых авидин-биотиновая реакция быть может применена в двухцентровом иммуноанализе. В обоих подходах применяли препараты иммобилизованных и биотинилированных антигена. В первом подходе поначалу иммобилизованные антитела вводили в реакцию с исследуемым прототипом и биотинилированными антителами. Потом добавляли конъюгат авидина либо стрептавидина с ферментом либо с хемилюминесцентным маркером. Во 2-м подходе заместо белкового конъюгата добавляли вольный авидин либо стрептавидин и потом добавляли биотинилированный фермент. В обоих вариантах определение производили спектрофотометрически либо по интенсивности люминесценции опосля прибавления соответственных субстратов. В качестве биотинилированных ферментов-маркеров применяли пероксидазу хрена, АВ+-зависимые ферменты, АТР-зависимые ферменты, пенициллиназу и щелочную фосфатазу. Разглядим некие результаты, приобретенные при помощи этих 2-ух подходов.

Главные принципы

Уже издавна понятно, что для обеспечения мощного взаимодействия биотина с гликопротеином яичного белка авидином требуется лишь уреиднос кольцо витамина (витамины — сборная по химической природе группа органических веществ, объединённая по признаку абсолютной необходимости их для гетеротрофного организма в качестве составной части пищи). Как следует, карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно видоизменять и таковым образом получать активные биотинилированные производные. А именно, биотин, связанный с макромолекулой, сохраняет способность связываться с активным центром авидина. Так как молекула авидина состоит из 4 схожих субъединиц, то с ней могут быть сразу соединены остатки биотина 2-ух разных биотинилированных белков. Эти характеристики авидии-биотинового комплекса обширно употребляются для решения разных задач, в том числе 1) обнаружения, локализации и чистки белков, углеводов и нуклеиновых кислот; 2) разработки способов двухцентрового иммунометрического анализа; 3) картирования эпигонов в гибридомной технологии.

Практическое применение авидин-биотиновой системы ограничивается высочайшей основностью авидина и наличием в его молекуле углеводных остатков, что в свою очередь обусловливает высочайший уровень неспецифического связывания. Наиболее 20 лет вспять в микробах Streptomyces avidinii был найден иной биотинсвязывающий белок, нареченный стрептавидином. Подобно авидину яичного белка, стрептавидин также образует весьма крепкий и специфичный нековалент-ный комплекс с биотином и состоит из 4 схожих субъединиц. Любая субъединица содержит один биотинсвязываюший центр. В отличие от авидина стрептавидин негликозилирован и имеет нейтральную ph. Авидин и стрептавидин очень различаются по аминокислотному составу, хотя оба богаты остатками триптофана. Некие характеристики этих белков приведены в табл. 1.

Таблица 1. Некие свойства авидина и стрептавидина

Свойства

Авидин

Стрептавиднн

tМолекулярная масса

67 000

60 000

Дескать. масса субъединицы

15 600

14 600 .

Kd (авидин-биотиновый комплекс), М

-10-15

-10-15

Еш (1 мг/мл)

1,54

3,4

Связывание биотина на субъединицу

1

1

Олигосахариды на субъединицу

1

0

Манноэа на субъединнцу

4-5

0

GlcNAc* ва субъединицу

3

0

Иэоэлектрическая точка, pi

>10

<7

Остатки аминокислот на субъеднницу

Триптофавы

4

8

Тироэины

1

6

Лиэины

9

4

Аргинины

8

4

Аспарагин + аспарагиновая кислота

15

12

Глутамин + глутаминовая кислота

10

9

Амиды

16

—

Стрептавидин можно употреблять заместо авидина либо в дополнение к нему в авидин-биотиновых системах. Он коммерчески доступен, и, подобно авидину, его можно очищать при помощи аффинной хроматографии на иминобиотиновой колонке. Так как бактериальный белок имеет нейтральную изоэлектрическую точку и не содержит углеводных остатков, то для него нехарактерны неспецифические взаимодействия, характерные авидину яичного белка. Хотя неспецифическое связывание авидина можно свести к минимуму при помощи хим либо каких-то остальных способов, стрептавиднн и его конъюгаты являются лучшим решением данной нам трудности.

В лаборатории для разработки разных способов иммуноанализа используются имеющиеся в продаже конъюгаты авидина с ферментами, также синтезированные препараты биотинилированных белков и стрептавидина с хемилюминесцентной меткой.

Получение биотинилированных белков

антитела и ферменты биотинилировали по ранее описанной методике с внедрением N-гидроксисукцинимидных эфиров производных биотина с различной длиной алкильной цепи. структура реагентов и схема реакции представлены на рис. 2. Свойство приобретенных препаратов инспектировали при помощи ELISA либо двухцентрового иммунометрического анализа.

Получение белков с хемилюминесцентной меткой

Стрептавиднн либо очищенные фракции IgG моноклональных способы анализа

При разработке способов двухцентрового иммунометрического анализа белков применяли меченые конъюгаты авидина либо стрептавидина или стрептавидин как связывающее звено меж биотинилированными антителами и биотинилированным ферментом. Величину сигнала в ферментативной реакции как в том, так и в другом случае определяли спектрофотометрически либо по интенсивности люминесценции зависимо от типа применяемой метки.

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов

Принципная схема этого способа представлена на рис. 3. Исследуемый эталон инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками поперечником 6,5 мм. Потом в систему вводили биотинилированные антитела к остальным эпитопам антигена. По окончании иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, либо содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. Зависимо от применяемого маркера измерение производили спектрофотометрически либо по интенсивности люминесценции.

Определение при помощи спектрофотометрии

Для исследования воздействия длины цепи меж молекулой биотина и моноклональным антителом на чувствительность анализа применяли систему, в какой излишек моноклональных аити-hGH антитела. По окончании реакции антиген — антитело в систему добавляли конъюгатавидин — щелочная фосфатаза и смесь инкубировали в течение 30 мин. Смеси упаривали в токе воздуха, добавляли субстрат м-нитрофенилфосфат и смесь инкубировали 45 мин при 37°С.

Образовавшийся продукт ферментативной реакции определяли по поглощению при 405 нм. Экспериментальные данные представляли в виде графика зависимости логарифма оптической плотности от логарифма концентрации hGH. Приобретенные данные свидетельствуют, что наиболее крутой наклон наблюдается в случае антител клона №69, биотинилированных при помощи N-гидроксисукцинимидного эфира с длинноватой цепью CONH3-). чувствительность анализа, достигаемая с длинноцепочечными биотинилированными антителами клона №69, сравнима с чувствительностью определения гормона при помощи обыденного конкурентноспособного РИА.

Определение методом измерения интенсивности люминесценции

Не считая спектрофотометрии для определения связанных биотинилированных антител мы также употребляли измерение интенсивности люминесценции. На этом рисунке эмблемой L обозначен хемилюминесцентный маркер, а моноклональные антитела к hGH биотинилировали через длинноватую цепочку CONH3-). В данном способе моноклональные антитела, связанные с полистирольными гранулками, инкубировали со эталонами либо пробами и с длинноцепочечными производными биотинилированных системы микропероксидаза — пероксид водорода. Калибровочный график зависимости логарифма интенсивности хемилюминесценции от логарифма концентрации hGH представлен на рис. 5. Предел обнаружения гормона при помощи данного способа составляет 3-10-5 м.ед. hGH/л либо 1,5 пг в пробирке, а рабочий спектр — от 4-10-5 до 10-1 м.ед. hGH/л. Коэффициент варианты анализа снутри серии равен 5,5%.

Обычный уровень hGH и его динамические конфигурации при искусственной стимуляции у здоровых пациентов определяли при помощи обыденного РИА и двухцентрового иммунометрического анализа. Коэффициент корреляции обоих способов составил 0,96. Не считая того, способ ИХМА дозволил найти уровень базальной секреции и слабенькие конфигурации концентрации hGH в плазме крови (внутренней средой организма человека и животных) у нездоровых гипопитуитаризмом в течение циркадного цикла, что нереально создать при помощи обыденного РИА. Приобретенные данные демонстрируют, что люминесцентный ИХМА в 10 раз наиболее чувствителен, чем имеющиеся радио- и иммуноферментные способы определения hGH.

Стрептавидин и биотинилированные ферменты как зонды

Принципная последовательность операций в этом способе представлена на рис 7. Связанные с носителем и биотинилированные моноклональные антитела инкубировали с пробой либо эталонами. По окончании иммунологической реакции поочередно добавляли либо стрептавидин и биотинилированную щелочную фосфатазу, либо ацетилированный авидин и биотинилированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. Зависимо от фермента величину сигнала регистрировали спектрофотометрически либо по интенсивности люминесценции. Примером такового подхода может служить определение hGH при помощи иммобилизованных на полистирольных гранулках моноклональных определения hGH, приобретенный при помощи биотинилированной щелочной фосфатазы и спектрофотометрического определения продукта ферментативной реакции, представлен на рис. 8.

чувствительность анализа сравнима с чувствительностью способов типа РИА. Коэффициент варианты снутри серии при анализе смешанной плазмы с концентрацией hGH 7.6-10″3 м.ед./л равен 6,5%, а коэффициент варианты меж сериями при анализе такого же пула — 7,4%.

На рис. 9 приведены результаты анализа образцов плазмы, взятых у пациентов, подвергнутых тесту «на стимуляцию секреции гормона роста. Приобретенные данные свидетельствуют, что при помощи этого способа можно регистрировать и количественно определять реакцию в тестах по стимуляции и угнетению синтеза hGH, проводимых для оценки резервов гормона в гипофизе. Все применявшиеся в этом способе реагенты устойчивы в течение по наименьшей мере 2-ух лет. Спектр калибровочной кривой дозволяет определять в одном анализе высочайшие и низкие концентрации hGH.

Заключение

Сравнительные данные для 2-ух способов двухцентрового иммунометрического анализа hGH приведены в табл. 2. чувствительность использованного для сопоставления способа РИА составляла 0,6-10-3 м.ед./л, а рабочий спектр — 10-3м.ед./л.

]]>