Учебная работа. Вакцинация и иммунопрофилактика инфекционных болезней

Учебная работа. Вакцинация и иммунопрофилактика инфекционных болезней

1 ВВЕДЕНИЕ

В конце ХХ века нет необходимости дискуссировать лет ее практического внедрения. Отлично понятно, что вакцинопрофилактика является ведущим фактором уменьшения заболеваемости, ослабления тяжести клинического течения и понижение смертности заболевших, уменьшение числа осложнений у перенесших заразные вопросец о его ликвидации), дифтерией, корью стали вероятными лишь благодаря тому, что были сделаны действенные вакцинные препараты против возбудителей этих зараз. Их применение в широких масштабах позволило защитить людей от инфецирования, создавать имунность организма человека к заразному агенту. Широкая иммунизация деток дифтерийным анатоксином сделала условия для практической ликвидации дифтерии в почти всех европейских странах в 70-е годы. К 1990 году число государств, в каких дифтерия не регилась, достигнуло 81%. (33, 73). Эффективность вакцинопрофилактики дозволила Глобальной организации здравоохранения (ВОЗ) поставить задачку — к 2000 году устранить местные случаи полиомиелита, дифтерии, столбняка новорожденных и ряда остальных зараз в европейском регионе.

Но, резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по дифтерии в Рф, на Украине и в Белорусии с 1990 года, с развитием томных и даже смертельных случаев болезней у невакцинированных поставило вопросец о необходимости неослабного контроля за проведением иммунизации детского населения и за состоянием иммунного статуса у взрослых с целью поддержания высочайшего уровня привитости.

Понятно, что вакцины, приобретенные классическими способами, вызывают ряд очень ненужных побочных эффектов, связанных с их реактогенностью и токсичностью. Применяемые в ежедневной практике вакцины — это малоконтролируемая сверхкомплексная смесь с не малым количеством балластных, в том числе высокотоксичных, загрязняющих компонент из микробных клеток, питательной среды, из клеток, на которых выращиваются вирусы (клеточные культуры, куриные зародыши, эпидермис телят, организм вводится ряд сложнейших комплексов. Современная тенденция развития вакцинопрофилактики характеризуется получением вакцинных препаратов с химически определенным антигенным составом и регулируемой иммуногенностью. В связи с сиим неувязка сотворения вакцин новейшего поколения тесновато связана с необходимостью получения высокоочищенных животрепещущих антигенов.

На современном шаге развития иммунологии и вакцинопрофилактики главным аспектом при выбирании антигена для вакцинации сделалось обеспечение способности получения водоспецифического иммунитета, также действенной защиты от аэрогенного инфицирования. Препараты, сделанные на базе белков внешной мембраны микробов, и до этого всего поринов, могут защищать от инфекции , вызваемой всеми типами данного вида мельчайшего организма (Портнягина О.Ю. и соавт.2004).

Порообразующий белок Yersinia pseudotuberculosis владеет иммунологических особенностей, позволяющих употреблять его в вакцинных продуктах. Выбор термостабильной субъединичной формы порина в качестве антигена обоснован его низкой гемолитической активностью, наиболее выраженными иммунными качествами по сопоставлению с его нативной тримерной формой. Но, иммуногенность этого белка, в целом, не высочайшая, что делает нужным применение для иммунизации сиим антигеном усилителя иммуногенеза, такового как липид-сапониновой матрицы иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ) для увеличения иммуноадъювантной активности бактериального антигена.

В работе поставлены задачки:

Разработка метода получения новейшего липид-сапонинового имуностимулирующего комплекса (ИСКОМ) на базе понижения токсических параметров и увеличения его эффективности.

Разработка метода получения антиген-содержащих липид-сапониновых ТИ-комплексов.

Проведение их сравнительной оценки с известными адъювантными носителями.

Увеличение эффективности вакцинации методом конструирования новейших адъювантных систем на базе ТИ-комплексов и иммуномодуляторов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

вакцинация иммуномодулятор заразный

2.1 Эффекторные механизмы иммунного ответа

Формирование иммунного ответа начинается со связывания антигена В- и Т-лимфоцитами, несущими мембранные белки-рецепторы, которые способны специфично распознавать отдельные участки — эпитопы (антигенные детерминанты чужеродных молекул). Иммуноглобулиновые нервные импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри В-лимфоцитов (как и вольные антитела) распознают расположенные на поверхности участки антигена — так именуемые В-эпитопы. нервные импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри Т-лимфоцитов ведут взаимодействие с пептидными фрагментами (Т-эпитопами) антигена, расщепленного в макрофаге. Т-эпитопы представлены на поверхности клеточки, будучи нековалентно связанными с белками МНС (Major Hystocompatibility Complex, основной комплекс гистосовместимости). Комплексы МНС класса 1 связывают фрагменты белков, которые экспрессируются в самой клеточке и расщепляются в протеосомах (собственные белки организма, белки вирусов, риккетсий и неких микробов). Комплексы МНС класса 2 связывают фрагменты антигенов, захваченных антигенпрезентирующей клеточкой по механизму эндоцитоза и подвергшихся протеолизу в эндолизосомальной системе. нервные импульсы По месту расположения и по выполняемым функциям выделяют экстерорецепторы интерорецепторы и пропри Т-клеток связываются с антигенными детерминантами, ассоциированными с МНС, потому специфика этого связывания определяется не только лишь структурой антигенного пептида, да и белками МНС. У человека эти белки получили заглавие HLA (Human Leukocyte Antigens, антигены лейкоцитов человека). При взаимодействие Т-лимфоцита с клеточкой, презентирующей антиген, происходит стимуляция лимфоцита, которая ведет или к его смерти, или к пролиферации соответственного Т-клеточного клона.

Любой из классов МНС кодируется группой локусов (генов), представленных множественными аллелями. Этот полиморфизм следует учесть как при выявлении Т-эпитопов, так и при конструировании вакцин.

Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) инициируют пуск сложного каскада реакций, приводящих к смерти клеток, несущих соответствущие Т-эпитопы. Большая часть ЦТЛ клеток несет маркер клеточной мембраны CD8 и ведет взаимодействие с МНС-1, чем и разъясняется главная роль ЦТЛ в устранении клеток, пораженных внутриклеточной заразой.

Клеточки, распознающие пептиды, ассоциированные с МНС-2 либо Т-хелперы, несут маркер СD4. Они делятся на подгруппы, отличающиеся по набору выделяемых ими цитокинов и, соответственно, различиями в каскаде запускаемых при содействии с антигеном иммунорегуляторных устройств. Считается, что клеточки подтипа Т-хелперы1 учавствуют в стимуляции цитотоксических реакций, а клеточки подтипа Т-хелперы2 стимулируют продукцию антигена (В-эпитопом) при помощи собственного иммуноглобулинового сенсора. Связанный таковым образом антиген подвергается интернализации и протеолизу с следующей презентацией приобретенных пептидов в составе МНС-2. Т-хелперы связываются с В-лимфоцитами, нисущими специальные Т-эпитопы процессированного антигена. Взаимодействие меж Т-хелперами и В-клетками содействует запуску действий пролиферации В-лимфоцитов. часть размножающихся В-клеток дает начало плазматическим клеточкам, синтезирующим антитела.

Часть Т- и В-лимфоцитов, пролиферирующих опосля стимуляции, дает начало клеточкам памяти, которые обуславливают наиболее резвое развитие иммунных реакций при вторичном ответе на соответственный антиген. На этом явлении и базирована вакцинация. (Соболев Б.Н. и соавт. 2003).

2.2 Короткая история сотворения вакцин

Вакцинация самое известное и более успешное применение иммунологических принципов в медицине. 1-ая вакцина была названа так по области британский доктор Э.Дженнер. Это сделалось первой научно обмысленной попыткой предупредить заразное социально полезной деятель»>болезнь человека (натуральную оспу).

Только столетие спустя Л.Пастером был сформулирован базовый принцип вакцинации: для сотворения напряженного иммунитета против высоко вирулентных микробов можно использовать препараты из тех же микробов, но с ослабленной методом определенного действия вирулентностью. Используя в согласовании с сиим высушенный спинной обычно расположенный в головном отделе тела и представляющий из себя малогабаритное скопление служащий для передачи в мозг важной для организма информаци»>нервных зайчика зараженного вирусом бешенства, и прогретые культуры бацилл сибирской язвы, Пастер сделал, на самом деле дела, макеты современных вакцин. В то же время, сделанная Э.Дженнером вакцина звериного происхождения, содержащая вирус коровьей оспы (гетерологичная), не получила потом как способ какого-нибудь продолжения. С возникновением клонально-селекционной теории Ф.Бернета (1957) и данных о Т- и В-дифференциации лимфоцитов (1965) стал понятен главный механизм вакцинации: находящийся в вакцине антиген должен вызывать клональную экспансию специфичных Т- и (либо) В-клеток, оставив опосля себя популяцию клеток иммунологической памяти. При последующей встрече с этим же антигеном конкретно они способны отдать вторичный ответ, который обычно резвее и эффективнее первичного (Ройт А. 2000).

2.3 Типы вакцин

Вакцинация приводит к формированию обретенного иммунитета, а Искусство сотворения вакцин заключается в разработке таковых антигенных препаратов, которые:

безобидны для организма

вызывают подходящую форму иммунного ответа и, не считая того,

доступны по цены для населения.

Выбор типа антигенного продукта для внедрения в качестве вакцины зависит от почти всех причин. Чем больше антигенов данного микроорганизма остается в вакцине, тем выше ее иммуногенный потенциал, и живы мельчайшие организмы, как правило, эффективнее убитых. Исключение составляют заболевания, патогенез которых определяется действием токсина. В этом случае основой вакцины может служить сам токсин . Очередное исключение — это вакцины, в каких нужные микробные антигены экспрессируются клеточками остальных бактерий, применяемые в качестве вектора.

Обычно вакцины подразделяют на живы, убитые и субъединичные

Живы вакцины конструируются на базе ослабленных штаммов микробов, потерявших вирулентность, но сохранивших антигенные характеристики. Живы вакцины при внедрении в организм приживляются, плодятся, вызывают генерализованный вакцинальный процесс и формирование специфичного иммунитета к патогенному мельчайшему организму, из которого получен аттенуированный штамм.

Убитые вакцины представляют собой инактивированные физическими (температура, УФ -лучи, ионизирующее излучение) либо хим (формалин, фенол) методами культуры патогенных либо вакцинных штаммов микробов и вирусов. Вакцинацию проводят 2-3 раза методом введения продукта: парентерально, внутримышечно, аэрозольно, время от времени перорально.

Субъединичные вакцины. В их обычно употребляют отдельные иммуногенные составляющие микробов, выделенные хим методом.

Основной вывод, который следует из практики внедрения субъединичных вакцин — внедрение отдельных компонент мельчайшего организма может вызвать иммунный ответ, достаточный для предотвращения инфекции , и, в то же время, избежать побочных эффектов, связанных с введением целостного патогенного агента. В отличие от {живых} вакцин, которые могут “возвратиться” к начальной вирулентной форме, отлично очищенные субъединичные вакцины неопасны в плане появления инфекции . Но применение субъединичных вакцин также связано с заморочек экономического, технологического, медикобиологического и общественного нрава:

— Долгое культивирование патогенных микробов, простых либо вирусов для производства иммуногенных компонент в промышленных масштабах обходится очень недешево.

— Огромные Издержки связанны с чисткой и детоксикацией вакцинных препаратов.

— Практически постоянно сохраняется риск, связанный с “утечкой” заразного агента.

— недозволено на сто процентов исключить побочных эффектов.

— В ряде всевозможных случаев, нередко в связи с высочайшей изменчивостью естественного заразного агента, не удается выделить иммуногенный компонент, способный вызвать действенный иммунный ответ.

С развитием способов молекулярной биологии возникла возможность выявлять, изолировать и клонировать био макромолекулы или их фрагменты, которые могут употребляться в качестве иммуногенных компонент. Молекулярные конструкции, собранные из таковых компонент, составляют базу субъединичных вакцин новейшего поколения. Они владеют последующими достоинствами:

— Применение относительно дешевеньких и неопасных технологий при разработке и производстве вакцинных препаратов. Так, при производстве вакцин на базе довольно маленьких пептидов (до 30 аминокислотных остатков) целенаправлено использовать хим синтез. В остальных вариантах употребляют рекомбинантные продукты, которые можно создавать в экономических системах экспрессии, от бактериальных либо вирусных векторов до растений.

— Внедрение малых иммуногенных фрагментов и легкость чистки значительно понижают риск появления побочных эффектов.

— Возможность разработки препаратов для перорального приема. В этом случае иммуноген попадает в организм через “естественные ворота инфекции ” — слизистые оболочки, которые владеют отлично развитой системой иммунного контроля. Не считая того, устроняются все отягощения, связанные с инъекциями. Крайние, как понятно, все почаще вызывают нехорошую реакцию посреди населения продвинутых стран.

— И, в конце концов, целенаправленное выявление участков молекул, перспек-тивных для сотворения вакцинных конструкций, осуществляется в самом начале работы. В связи с резвым повышением размера доступной инфы о геномах микробов и разработкой соответственного аналитического инвентаря возникла возможность проводить поиск возможных иммуногенных компонент на базе компьютерного анализа структуры биополимеров, до этого всего их первичной структуры, представленной в виде символьных строк — нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Табл.1 Главные типы применяемых в истинное время вакцин

Главные типы вакцин

Тип антигенного продукта

Примеры вакцин

Живы

мельчайшие организмы

Штаммы одичавшего типа

вирус коровьей оспы (против натуральной оспы), микобактерии — возбудители мышиного туберкулеза (из истории противотуберкудезной вакцинации)

Ослабленные (по иммуногенности), либо атенуированные штаммы

Поливалентная (оральная вакцина Сейбина против полимиелита), коревая и паротитная, против краснухи, против желтоватой лихорадки (штамм 17D), против ветряной оспыопоясывающего лишая (герпесвирус 3 человека), БЦЖ

Убитые мельчайшие организмы

вирусы

Полиовирусная Солка, против гриппа, гепатита А, бешенства

бактерии

Коклюшная, брюшнотифозная, холерная, сыпнотифозная, противочумная

Субклеточ-ные фрагменты микробных клеток

Капсульные полисахариды

Пневмококковая, менингококковая, против Haemophilus influenzae

Поверхностный антиген

Против гепатита В

Анатоксины

Столбнячная, дифтерийная

Чрезкожная иммунизация

токсины — ядовитый — яд биологического происхождения), вакцинные антигены

Дерматологические пластыри — против столбняка, бешенства, дифтерии, гриппа

Вакцины — леденцы

Сахар трегалоза + белковые молекулы

Стадия разработки.

Микрокапсу-лированные вакцины

Для получения употребляются биодеградирующие микросферы, которые с одной стороны защищают антиген от вредного воздействия окружающей среды, а с иной стороны распадаются и высвобождают антиген в данное время.

Всеохватывающая вакцинация против нескольких зараз сразу. Испытывается в экспериментальных критериях.

Синтетичес-кие пептидные вакцины

Синтетические пептиды.

Экспериментальные вакцины получены против дифтерии, холеры, стрептококовой инфекции , гепатита В, гриппа, ящура, клещевого энцефалита, против пневмококковой и сальмонелезной инфекции .

На базе рекомбинантных ДНК

Приобретенный методом клонирования и экспрессии гена; приобретенный способом включения генов в экспрессируемые векторы. Незапятнанная ДНК .

Против гепатита В (экспрессия в клеточках дрожжей), эксперементальные препараты

Антиидиотип-ические вакцины

Вакцины на базе антиидиотипических метод эффективен благодаря тому, что население в большинстве вакцинировано против столбняка и владеет Т-клетками иммунологической памяти, распознающими токсин . Но целенаправлено употреблять в качестве носителя белок такого же микроорганизма, против которого ориентирована конструктируемая вакцина (а именно, пневмококовая, малярийная и т.д.) (табл 2).
Иммунная система (основным образом В-клетки и антитела) распознает до этого всего поверхностные антигены большинства микробов и отвечает на их. Они служат безобидной и действенной вакциной в тех вариантах, когда вторичное образование организм

Комментарий

Бактерии

Neisseria

meningitidis

Эффективны группоспецифические полисахариды А и С; полисахарид группы В неиммуногенен

Streptococcus

pneumoniae

Известны 84 серотипа пневмококков; вакцины содержат не наименее 23

Neisseria

gonorchоeae

Не весьма эффективна

Echerichia

coli

Употребляется в ветеринарии

Haemophilus

Influenzae

Все полисахаридные вакцины требуют коньюгации с белковым носителем

Вирусы

вирус гепатита А

Защищает наиболее 95 % вакцинированных

Более успешными оказались вакцины против инкапсулированных микробов, капсульные полисахариды которых удается получить в препаративных количествах, и против вируса гепатита В, владеющего необыкновенным свойством сверхсинтеза поверхностного антигена (НВs).
2.4 Разработка вакцинных препаратов
Если установленно, что защиту обеспечивает маленькой пептид, удобнее, может быть, получать его методом синтеза либо клонирования в пригодном векторе экспрессии. Пример удачной реализации этого подхода — получение HBs-антигена, клонированного в клеточках дрожжей. Сделанная таковым методом вакцина вытеснила сейчас HBs-вакцину первого поколения, которую приходилось готовить трудозатратным способом выделения HBs-антигена из крови носителей вируса и следующей чистки.
Привлекательность молекулярного клонирования состоит в том, что в продукт можно ввести доп последовательности, к примеру нужные В- и Т-клеточные эпитопы, скомбинированные разным образом для оптимизации иммунного ответа. Т-клетки распознают линейные аминокислотные последовательности, тогда как В-клетки отвечают на трехмерную конфигурацию эпитопов антигена. Потому пептиды отлично работают в качестве Т-клеточных эпитопов, но не способны имитировать структурированные В-клеточные эпитопы. Даже в том случае, если В-клеточная детерминанта имеет линейную конфигурацию, антитела, приобретенные к вольному гибкому пептиду, не связываются с ним так же нормально, как с схожей последовательностью в составе нативного белка, где она имеет наиболее твердую структуру.
Предстоящее развитие подхода с применением клонирования генов подразумевает введение подходящего гена в таковой вектор, который способен опосля инъекции в организм обеспечивать репликацию и экспрессию с образованием огромного количества антигенов in situ.
При разработке вакцины, до этого всего, необходимо найти эффекторные механизмы иммунного ответа, которые должны быть реализованны в ответ на введение продукта. Различные типы вакцинных конструкций индуцируют разные эффекторные механизмы. Синтетические пептиды либо рекомбинантные белки вызывают, в главном, ответные реакции В-клеток и Т-клеток, с вероятной Т-хелперной стимуляцией гумморального иммунитета. Для индукции цитотоксического иммунитета необходимы остальные носители — такие как вирусные векторы либо ДНК -вакцины. Нужно принимать в расчет и реакцию организма на адъюванты.
Принципиально учесть и тип инфекции служат слизистые оболочки (самый всераспространенный из естественных методов инфицирования), антитела типа IgА играют ведомую роль в реакциях гуморального иммунитета. В связи с сиим полностью обусловлена разработка вакцинных препаратов, которые могут вводиться per os.
Вакцины должны владеть достаточной иммуногенностью; в случае убитых либо субъединичных вакцин ее часто требуется увеличивать, применяя адъювант.
2.5 Адъюванты липидной природы, виды адъювантов
Адъювант — вещество, неспецифически стимулирующее иммунный ответ на антиген.

Вольный антиген обычно стремительно распространяется из места инъекции и подвергается элиминации из организма, что негативно сказывается на иммунном ответе. Принцип деяния неких адъювантов как раз и состоит в том, что они делают резервуар, в каком антиген долгое время сохраняется или в вольном виде во внеклеточном пространстве, или снутри фагоцитирующих клеток, обеспечивая таковым образом прелангацию процессинга и презентацию антигена.

В 1920-х гг. при разработке гетерологических сывороток для процесс заразных болезней человека было найдено, что некие вещества, а именно соли алюминия, добавленные в раствор антигена либо эмульгированные в нем, очень усиливают образование к примеру, в вакцинах, содержащих дифтерийный и столбнячный анатоксины. действие адъювантов на иммунный ответ в главном обосновано, как предполагается, 2-мя их активностями:

способностью задерживать (либо даже копить) антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитами (эффект “депо”);

способностью модулировать иммунокомпетентные клеточки, приводя иммунную систему к наиболее высочайшей многофункциональной готовности, при ответе на антигенное раздражение.

Соли алюминия действуют возможно, основным образом как депо, индуцируя образование маленьких гранулем, в каких они задерживаются совместно с адсорбированным антигеном. Адъюванты новейшего поколения, такие как липосомы и иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ), разрешают достигнуть той же цели; заключенный в их антиген доставляется к антигенпрезентирующим клеточкам.

Более известен полный адъювант Фрейнда (ПАФ), используемый лишь для иммунизации лабораторных звериных; он представляет собой масляную суспензию убитых клеток Mycobacterium tuberculosis; перед введением звериному этот продукт эмульгируют в аква растворе антигена. Адъювантный эффект, по-видимому, обоснован конкретно тем, что антигенспецифический иммунный ответ развивается в лимфоидной ткани , уже содержащей упомянутые фармакологически активные бактериальные продукты. Ответ на введеный без их, незапятнанный бактериальный антиген можно разглядывать как искусственную ситуацию, которая не встречается в природе.

Адъюванты бактериального происхождения, такие как клеточные стены микобактерий, эндотоксины и др., действуют возможно, в главном методом стимуляции образования соответственных цитокинов. Это предположение подтверждается тем фактом, что цитокины действуют как действенные адъюванты, в особенности если соединены конкретно с антигеном.

Цитокины — собирательное заглавие для секретируемых лейкоцитами и время от времени иными клеточками молекул, опосредующих межклеточное взаимодействие при иммунном ответе.

Применение цитокинов в большей степени целенаправлено при вакцинации лиц, страдающих иммунологической дефицитностью, для которых вакцины обыденного состава нередко не эффективны.

Можно также надежды, что применение цитокинов дозволит придавать иммунному ответу необходимое направление — к примеру, когда лучше образование лишь Тх-1 либо Тх-2 клеток памяти.

В истинное время не существует единой формулы вакцин, которые бы работали нормально, вызывая мощный долгий иммунитет без ненужных побочных эффектов. Но благодаря достигнутому прогрессу в области иммунологии и молекулярной биотехнологии, стали вероятными идентификация и получение различных антигенов. Но, как правило, личные очищенные антигены, к примеру, поверхностные белки вирусов, либо отдельные эпитопы проявляют слабенький иммунный ответ, недостающий для полной защиты организма. Для усиления иммуногенности они должны представляться иммунной системе соответствующим образом. С данной нам целью могут быть применены разные адъюванты (табл.3).

Табл.3 Виды адъювантов

Виды адъювантов

адъювант

Применяется при вакцинации населения

Эксперементальная стадия разработки либо очень высочайшая токсичность для человека

Неорганичес-кие соли

1)гидрооксид алюминия (алгидрогель)

2)фосфат алюминия

3)фосфат кальция

Гидрооксид берилия

Система

доставки

1)липосомы

2)иммуностимулирующие

комплексы

3)блок-сополимеры

4)препараты пролонгированного высвобождения

5)БЦЖ

Бактериаль-ные продукты

Bordetella pertussis (с дифтерийным и столбнячным анатоксином)

1)mycobacterium bovis & масло

(полный адъювант Фрейда)

2)мурамилдипептид

Природные

медиаторы (цитокины)

1)ИЛ-1

2)ИЛ-2

3)ИЛ-12

4)ИФН

Некие лекарствен-ные препараты

Левамизол, дибазол, препараты тимуса (тималин,Т-активин, тимоген и др.)

Полисаха-риды, производные нуклеиновых кислот, синтетические полинуклеотиды

Зимозан, продигиозан, нуклеинат натрия.

Поли И:Ц

Система доставки типа наночастиц, обеспечивающая защиту включенных в нее антигенов от брутальных причин наружной среды и способные сформировывать усиленный иммуный ответ, именуется носителем. Более известны два вида носителей:

на базе фосфолипида — это липосомы

на базе фосфолипида, структура липосом. Липосомы — полые частички, содержимое которых ограниченно мембраной, образованной двойным слоем молекул. Липосомы образуются при механическом диспергировании взвеси набухших фосфолипидов в воде. В качестве липидной фазы липосом обычно употребляют фосфотидилхолин — главный компонент био мембран.

характеристики липосом. Важным свойством липосом является их способность включать в себя и задерживать вещества белковой природы. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, что описывает их свойства. Они не токсичны, биодеградируемы, при определенных критериях могут поглащаться клеточками, их мембрана может соединяться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого (рис. 1).

Набросок 1 методы проникания содержимого липосом в клеточку

Встраивание белков в липидный бислой обычно именуют реконструкцией, а получаемые при всем этом белоксодержащие липосомы — протеолипосомами (Борсуков Л.И.,1998). Иммуноадъювантное действие протеолипосом сделалось одним из основных направлений их практического внедрения. Больший Энтузиазм у исследователей для реконструкции очищенных вирусных антигенов в липосомы завлекли поверхостные гликопротеины вируса гриппа — геммаглютинин (ГА) и нейраминидаза (НА), которые являются его главными протективными антигенами, но в очищенном виде владеют низкой иммуногенностью. Используя иммуноадъювантные характеристики липосом, почти все российские и забугорные исследователи проводят интенсивный поиск методичиских подходов для роста антигенной активности субъединичных грипозных вакцин. Механизм усиления липосомами иммунного ответа на инкорпорированный антиген до конца неясен. Высказывается мировоззрение о том, что это соединено с депонирующим эффектом — неспешным высвобождением антигена, также способностью везикул и связанного с ними антигена мигрировать в региональные лимфотические узлы в месте инъекции и потенцировать иммунный ответ.

Получение липосомальных препаратов.

исследователей предложены способы получения липосомных препаратов:

способ, в каком фосфолипиды высушивают на носителях из хлорида натрия либо сорбита. При следующем добавлении воды к высушенным фосфолипидам (пролипосомам) крайние набухают, в то время как носитель стремительно растворяется. В этот момент формируются липосомы. Если с пролипосомами смешать разные белки либо целые вирусные частички в сухом виде, то при добавлении воды формирующиеся липосомы их захватывают с эффективностью от 65 до 100%. Таковым методом получены липосомный инсулин, интерлейкин — 1, бета-каротин и инактивированная гриппозная вакцина.

для включения антигенов в липосомы можно употреблять способ, основанный на дегидрации заблаговременно сформированных липосом методом их лиофильного высушивания с следующей регидратацией. Приобретенные сиим способом протолипосомы содержат в себе до 40 % использованного ГА и оказывают иммунноадъювантное действие при внутримышечном внедрении мышам.

Плюсы и недочеты, связанные с внедрением липосом.

Липосомы не только лишь оказывают иммуноадъювантное действие, да и могут усиливать репродукцию вируса в клеточках. В литературе описан парадокс стимуляции липосомами экспериментальной гриппозной инфекции . Интарназальное введение пустых липосом сразу с патогенным вирусом белоснежным мышам приводило к значительному повышению заразного титра вируса в суспензии легочной ткани и резкому повышению числа погибших звериных. Создатели разъясняют приобретенные результаты вероятной дестабилизацией липидного бислоя плазматических мембран чуствительных к вирусу клеток при действии липосом, возникающей в итоге усиления эндоцитоза либо слияния мембран. Эти процессы могут наращивать эффективность проникания вируса в клеточки и их нужно учесть при использовании липосомных препаратов. По-видимому, включение липосом в состав жив грипозной вакцины может дозволить понизить дозу продукта, нужную для получения специфичного иммунного ответа.

Итогом интенсивных научных поисков получения действенных липосомальных иммунопрепаратов, разрешенных для внедрения на людях, явилась виросомная вакцина против гепатита А. Эффективность и практическое применение остальных разработанных виросомных вакцин, по оценкам создателей, пока разноплановы и требуют доп исследовательских работ.

Липосомы и их неповторимые характеристики продолжают оставаться объектом внимания ученых различных государств как многообещающая модель для разработки вакцин новейшего поколения. Включение в липосомы иммуномодуляторов (индукторов гамма-интерферона) быть может применено при разработке комплекснвх препаратов для вакцинопрофилактики. Таковая система дозволит обеспечить не только лишь эффективную адресную доставку антигена к иммунокомпетентным клеточкам, да и равновесную стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета с расширенным диапазоном защиты на долгий срок. (Мигунов А.И. и соавт.2001).

2.7 Искомы

структура ИСКОМ.

ИСКОМы (иммуностимулирующие комплексы) как потенциальные средства транспортировки антигенов в первый раз были описаны в 1984 году. 10 годами ранее возникли сообщения о том, что при выделении вирусных субъединиц с внедрением сапонина в качестве детергента образуются субмикроскопические структуры в качестве реликвий, но в то время не было оценено значение сапонинов для конструирования субъединичных вакцин.

В истинное время смесь тритерпеновых гликозидов Quill A, экстрагируемых из коры американского дерева Quillaja saponaria , является неотклонимым компонентом традиционных ИСКОМ. Основой хим структуры этих сапонинов является гидрофобный тритерпеновый либо стероидный агликон, к которому присоединяются два гидрофильных углеводных остатка. Благодаря углеводной части Quill A растворим в воде. Установлено, что сапонины из Quillaja saponaria владеют адъювантным эффектом не только лишь при парентеральном, да и при пероральном внедрении в организм.

Отрицательное действие составляющих ИСКОМ.

К огорчению, сразу с сиим Quill A, проявляет токсическое действие, уровень которого зависит от метода введения. Весьма низкая токсичность наблюдается при пероральном применении сапонинов. Напротив, при внутривенном внедрении возникает высочайшая гемолитическая активность Quill A, которая возможно является главной предпосылкой токсичности этого продукта. Потому применительно к человеку рассматривается лишь пероральное внедрение Quill A, хотя было показано, что внутримышечное введение может вызывать лишь умеренное гистопатологическое и никакого гематологического побочного деяния у звериных. В связи с сиим ведутся поиски нетоксичной фракции Quill A, которая владела бы не наименьшей ИСКОМ-образующей способностью, чем начальная фракция. возможно, некие фракции тритерпеновых гликозидов (QS-21, QH-A, QH-B и QH-C), выделенные из растения Quillaja saponaria (Molina), можно разглядывать как многообещающие адъюванты для человечьих вакцин.

Получение ИСКОМ.

Для получения ИСКОМ употребляют гидрофобный белковый антиген, который солюбилизируют детергентами (тритон Х-100, октилглюкозид, MEGA-10 и др.), которые потом убирают в итоге диализа либо гель-хроматографии. сейчас еще не выработаны аспекты, при помощи которых можно было бы предвидеть возможность встраивания какого-то определенного белка в ИСКОМы. Весьма гидрофобные белки, которые не могут быть представлены в мономерной форме, встраиваются неэффективно. Весьма огромные белки также слабо встраиваются из-за стерических препятствий. Так как ИСКОМы весьма мелкие частички (около 40 нм), у каких отсутствует внутренний размер, водорастворимые, гидрофильные белки обычно не инкапсулируются. В этом случае частичная денатурация белка может содействовать экспонированию их гидрофобной части и улучшению встраивания в целом гидрофильного белка. иной метод состоит в конъюгации белка либо пептида с липидом.

Не считая того, для сотворения частиц ИСКОМ de novo требуется липидные составляющие, почаще всего фосфолипиды. Более желаемым фосфолипидом является фосфатидилэтаноламин. Внедрение фосфатидилхолина заместо фосфатидилэтаноламина приводит к образованию ИСКОМ-подобных частиц с наиболее низкой плотностью, гетерогенных по размеру и морфологии. ИСКОМы могут создаваться и без фосфолипида, но его присутствие нужно для включения антигена.

Обычно в состав ИСКОМ заходит 60-70% Quil A, 10-15% электрических снимках было записанно образование круглых ИСКОМ-подобных пор размером около 20-30 нм на эритроцитарных и липосомальных мембранах, содержащих находящийся в клеточных мембранах всех {живых} организмов кроме безъядерных»> природный жирный . Это косвенно свидетельствует о том, что гликозиды голотурий также способны сформировывать ИСКОМы. Для разъяснения мембранолитической активности сапонинов (тритерпеновых и стероидных гликозидов) была предложена модель поры, которую сформировывают мономерные гликозид-холестериновые комплексы.

Набросок 2. структура ИСКОМ.

Под электрическим микроскопом плохо контрастированные препараты ИСКОМ смотрятся как сферические агрегаты, состоящие из 20 субъединиц с темными дырами в центре (рис.2) (Kersten G. F. A. 2003). Из что был изготовлен вывод, о том, что субъединицы — это кольцеобразные мицеллы с иногда в центре. Кольцо мицеллы образовано монослоем из чередующихся молекул Quill A, стороны от гидрофобного агликона размещаются две углеводные цепочки, одна из которых содержит остаток глюкуроновой кислоты, мицеллы и сами ИСКОМ при нейтральной рН заряжены негативно. Электростатическое отталкивание содействует поддержанию коллоидного состояния ИСКОМ. количество углеводных групп Quill A экранируют их внешную поверхность. Понижение количества Quill A приводит к агрегации мицелл в итоге роста гидрофобности их поверхности. Присутствие фосфатидилэтаноламина также содействует наиболее рыхловатой упаковке мицелл снутри ИСКОМ.

метод деяния.

Метод деяния ИСКОМ в составе вакцин, до этого всего, определяется присутствием в их Quill A, хотя до сего времени не известен четкий механизм его адъювантного деяния. Любопытно, что мицеллярный раствор Quill A проявляет наименьший адъювантный эффект по сопоставлению с ИСКОМами. Мощная гемолитическая активность Quill A возможно связана с образованием комплексов с мембранным холестерином. Это в свою очередь вызывает воспалительную реакцию в месте введения ИСКОМ, к которому привлекаются лимфоциты и макрофаги («эффект депо»). Но местная воспалительная реакция может быть не единственная причина адъювантной активности, так как воспалительную реакцию можно убрать без утраты адъювантной активности добавлением липосом, содержащих организм звериных является завышенный уровень антител, также мощный Т-клеточный ответ, рестриктированный как по МНС-I, так и по МНС-II классам. А именно, это действие было показано на мышах с внедрением различных вирусных антигенов. При этом стимуляция Т-клеток типа Th1 сопровождается образованием интерлейкина-2 и интерферона (IFN-г). ИСКОМы также стимулируют синтез интерлейкина-1 спленоцитами мышей, который, в свою очередь, содействует вербованию нейтрофилов к месту инъекции ИСКОМ и спонтанной пролиферации спленоцитов. Парентеральная иммунизация при помощи ИСКОМ вызывала широкий круг эффекторных иммунных реакций, включая все классы IgG и клеточно-опосредованные иммунные ответы, такие как гиперчувствительность замедленного типа in vivo, антиген-специфический пролиферативный ответ и продукция цитокинов in vitro. В различных работах были тщательно рассмотрены специальные CD4+-зависимые иммунные ответы, которые связаны с Th1- и Th2-зависимыми эффектами, что видно и по IgG изотипам, и по продукции интерлейкинов.

Перспективы модификации состава ИСКОМ.

ИСКОМы представляют собой гибкую систему, хоть какой компонент которой, в принципе, быть может замещен иным соединением. Это касается даже тех компонент, которые являются структурообразующими. В качестве липидных составляющих ИСКОМ почаще всего употребляются главные мембранообразующие липиды — фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и фосфатидилхолин (ФХ). Диапазон иммуноадъювантных параметров ИСКОМ можно расширить методом включения заместо этих неиммунотропных фосфолипидов остальных амфифильных молекул, владеющих иммуномодулирующей, противоопухолевой и иными видами био активности.

В качестве источника таковых веществ могут быть применены морские макрофиты (макроводоросли и травки), которые, как понятно, владеют различной био активностью (внимание диетологов, фармацевтов, биотехнологов и остальных профессионалов. Может быть, что разные виды био активности морских макрофитов соединены с высочайшим содержанием гликоглицеролипидов (моногалактозилдиациглицерин (МГДГ), дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилгицерин (СХДГ)) (Рис. 3).

МГДГ

ДГДГ

СХДГ

Рис. 3. Хим структура гликоглицеролипидов

R1 и R2 — углеводородные цепи остатков жирных кислот, — (-СН2)n-CH3)

До сего времени био роль гликоглицеролипидов недостаточно исследована, хотя понятно, что МГДГ из зеленоватых водных растений проявляет противоопухолевое действие, а СХДГ из морских водных растений ингибирует ДНК -полимеразу и оборотную транскриптазу вируса иммунодефицита человека. Ничего непонятно и о адъювантных свойствах этих веществ, но полисахариды и остальные гликоконъюгаты нередко проявляют подобные характеристики, и некие из их употребляются как адъюванты. В отличие от ФХ и ФЭ, эти три гликолипида доминируют в тилакоидных мембранах хлоропластов, где фактически протекают фотосинтетические процессы в растениях, тогда как ФХ и ФЭ в главном локализованы в нефотосинтезирующих мембранах, к которым в том числе можно отнести мембраны звериных и микробов. Таковым образом, почти все мембраны содержат неламеллярные (небислойные) липиды (ФЭ и МГДГ), которые благодаря собственной внутренней структуре и/либо химическим свойствам, предпочитают не создавать планарный бислойный агрегат в аква среде, и ламеллярные, либо бислойные липиды (ФХ, ДГДГ, СХДГ), напротив, предпочитающие самоорганизовываться в надлежащие надмолекулярные ансамбли. По-видимому, соотношение меж ламеллярными и неламеллярными липидами имеет принципиальное функциональное конфигурации критерий окружающей среды. Наиболее того, установлено, что даже в {живых} системах вероятна подмена небислойного фосфолипида на чужеродный небислойный гликоглицеролипид, что сопровождается улучшением неких многофункциональных параметров как мембраносвязанных белков, так и клеток в целом. возможно, бислойные фосфолипиды также могут замещаться надлежащими гликолипидами. В связи с сиим мы представили, что в качестве более адекватной подмены ФЭ либо ФХ в составе ИСКОМ, можно употреблять схожие им по структурно-функциональным свойствам гликолипидные соединения морских макрофитов.

нужно также отметить, что био активность морских макрофитов связана с присутствием в их полиеновых жирных кислот, которые, как понятно, в огромных количествах входят в состав гликоглицеролипидов. Морские макрофиты относятся к группе пойкилотермных организмов и высокочувствительны к изменениям температуры окружающей среды. Колебания температуры, до этого всего, влияют на состав жирнокислотных остатков и, как следует, фазовых переходов мембранообразующих липидов пойкилотермных организмов. В свою очередь температура фазовых переходов липидов может влиять на иммуногенность и иммуноспецифичность липид-белковых комплексов таковых как, к примеру, ИСКОМы.

Принимая во внимание все эти происшествия, была изучена ИСКОМ-формирующая способность различных по физико-химическим свойствам гликоглицеролипидов, выделенных из морской бурой водные растения Laminaria japonica. Кроме того, что МГДГ, ДГДГ и СХДГ ламинарии различались по количественному составу жирных кислот, термическим переходам, электрической микроскопии и ультрацентрифугирования было показано, что три гликолипида значительно отличались и по ИСКОМ-образующей возможности. Включение самого ненасыщенного и менее гидратируемого посреди исследованных гликолипидов, МГДГ, не имели кольцеобразную форму с порами и коэффициент седиментации 19S, обычный для ИСКОМ (рис.4). Подмена МГДГ на ДГДГ приводила к понижению ИСКОМ-образования, тогда как в присутствии СХДГ ИСКОМ совершенно не создавались. возможно, нрав суперструктуры липида является определяющим для проявления ИСКОМ-формирующей возможности. А именно, наиболее действенное включение МГДГ можно разъяснить способностью к формированию инвертированной гексагональной мезофазы в аква среде, также сравнимо наименьшим гидрофильно-липофильным балансом этого гликолипида, что также может оказывать существенное воздействие на адъювантные характеристики амфипатических структур (Санина Н.М., Попов А.М. 2003).

2.8 Тималин (получение, применение как адъюванта)

Тималин в первый раз был выделен в 1974г. В.Г. Морозовым и В.Х. Хавинсоном из вилочковой железы телят. строением и выполняемыми функциями»> объединённых общим происхождением тимуса обрабатывали ацетоном, гомогенизировали, экстрагировали 3% уксусной кислотой в присутствии хлорида цинка в протяжении 72 часов и к супернатанту добавляли ацетон. Осадок неоднократно промывали ацетоном и высушивали. Этот комплекс полипептидов в предстоящем подвергался доборной чистке, из него удаляли труднорастворимые фракции. Выделенный комплекс получил заглавие тималин и был разрешен Фармокологическим комитетом для клинического внедрения в 1977 г. При эксперементальном исследовании найден широкий диапазон фармакологической активности тималина, проявляющийся в восстановлении ряда физиологических функций организма: иммунологической реактивности, гемопоэза, гомеостаза, нейроэндокринной регуляции.

При внедрении интактным крысам в протяжении 2 недель тималина у их меняются характеристики иммунитета и неспецифической резистентности организма: возрастает антибактериальная активность сыворотки и содержание бета-лизинов.

Введение тималина активизирует клеточную популяцию лимфоидных органов, вызывает омоложение клеточного состава и увеличивает миграцию клеток лимфоидной ткани . Инъекции тималина индуцируют вспышку экстрамедулярного кроветворения в селезенке, приводят к существенному повышению содержания нормобластов.

Более отлично применение тималина при тимусзависимой иммунологической дефицитности. В опытах на звериных установлено, что он провоцирует реакции клеточного иммунитета и иммунный ответ на тимусзависимые антигены. Иммуномодулирующие препараты на базе пептидов тимуса можно условно поделить на три поколения.

Препараты первого поколения представляли собой экстракты тимуса, обогащенные активными факторами. К ним относятся российские препараты Тималин, Тактивин, Тимоптин, также ряд забугорных препаратов.

Препараты второго поколения представляют собой синтетические пептиды, воспроизводящие структуру нативных пептидов тимуса. Так, Тимопоэтин (Arg-Lys-Asp-Val-Tyr) представляетсобой активный фрагмент тимопоэтина, соответственный остаткам 32-36, а Тимоген — это дипептид (Glu -Trp), присутствующий в вольной форме в экстрактах тимуса.

В конце концов, третье поколение иммуномодуляторов данной нам группы представляет собой синтетические пептиды, являющиеся измененными аналогами природных пептидов тимуса. К ним относятся Имунофан, Тимодеприсин (D-изомер Тимогена).

Основная область клинического внедрения этих препаратов — иммуностимуляция. Так как установленно, что тимусные пептиды оказывают стимулирующее действие, кроме Т-клеток, на естественные киллеры и дендритные клеточки, их стали использовать (в сочетании с химиотерапией) для исцеления злокачественных опухолей. Показано, к примеру, что THF-g2 в сочетании с химиотерапией оказывает антиметастатический эффект при раке легкого. При клиническом использовании такового пептида, как имунофан, учитывается антиоксидантный эффект. В конце концов, оптический изомер Тимогена Тимодеприсин показал иммунодепрессивное действие и испрользуется для предотвращения реакции трансплантант-против-хозяина при пересадках аллогенного костного мозга .

Эффект тимических препаратов, обычно, полный (другими словами в целом оптимизирующий иммунную систему) и не бывает резко выраженным. Эти препараты рассматриваются как мягенькие иммуномодуляторыи, фактически, не вызывают осложнений.(Хавинсон В.Х. и соавт.2002).

Таковым образом, Тималин и остальные препараты тимуса могут быть кандидатами к применению и в качестве адъювантов, обеспечивая мягкое многокомпонентное действие на иммунную систему, увеличение дифференцировке ее клеточных частей, оптимизируя межклеточную кооперацию и результируясь в переходе иммунной системы на наиболее высококачественный структурно-функциональный уровень.

В рамках стратегии с применением иммуномодулятора мы добавили в ИСКОМный матрикс и в ТИ-комплекс известное иммунотерапевтическое средство тимического происхождения — официнальный продукт Тималин производства Микроген (Наша родина, Уфа), комплексом пептидов, владеющими иммуномодулирующим действием. Тималин вводили внутрибрюшинно без помощи других и в составе комплексов в дозе 300 мкг/мышь.

2.9 Порины — антигены белковой природы.

Порины принадлежат к бета-структуированным интегральным мембранным белкам, образующим в нативной мембране олигомерные структуры (почаще тримеры). По своим фиэико-химическим свойствам порины представляют собой слабокислые белки, имеющие необыкновенно огромное для интегральных белков количество полярных аминокислотных остатков. В стабилизации пространственной структуры поринов как в внешной мембране, так и в изолированном состоянии кроме гидрофобных взаимодействий существенную роль играют водородные и ионные связи. Конкретно сиим обусловленна необыкновенная устойчивость этих белков к протеазам, завышенной температуре и иным денатурирующим факторам. Главный структурной индивидуальностью поринов является отсутствие в их полипептидной цепи довольно протяженной последовательности, состоящей из гидрофобных аминокислотных остатков, схожей той, что «прошивает» мембранный бислой в случае альфа-спирализованных мембранных белков.

Роль поринов по осуществлению контроля за проницаемостью внешной мембраны микробов связана с конформационной пластичностью этих белков, т. е. способностью создавать огромное количество конформационных состояний (интермедиаторов). Эти характеристики поринов употребляются клеточкой для адаптации микробов к изменению критерий окружающей среды. Как правило, в клеточке есть разные популяции поринов с высочайшей степенью гомологии на уровне первичной структуры, но с разным поперечником пор. Клеточка регулирует проницаемость внешной мембраны средством экспрессии поринов с наименьшим либо огромным поперечником пор в ответ на изменение критерий и действие разных причин наружной среды.

На современном шаге развития иммунологии и вакцинопрофилактики главным аспектом при выбирании антигена для вакцинации сделалось обеспечение способности получения водоспецифического иммунитета, также действенной защиты от аэрогенного инфицирования. Препараты, сделанные на базе белков внешной мембраны микробов, и до этого всего поринов, могут защищать от инфекции , вызваемой всеми типами данного вида мельчайшего организма (Портнягина О.Ю. и соавт.2004).

Порообразующий белок Yersinia pseudotuberculosis владеет иммунологических особенностей, позволяющих употреблять его в вакцинных продуктах. Выбор термостабильной субъединичной формы порина в качестве антигена обоснован его низкой гемолитической активностью, наиболее выраженными иммунными качествами по сопоставлению с его нативной тримерной формой. Но, иммуногенность этого белка, в целом, не высочайшая, что делает нужным применение для иммунизации сиим антигеном усилителя иммуногенеза.

]]>