Загрузка...
Учебная работа. Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ
Целью нашей работы являлось создание на базе эукариотического вектора pcDNA_3 плазмидной конструкции, содержащей ген нуклеокапсидного (N) белка вируса ГЛПС и исследование вероятного иммунного ответа, индуцированного инъекцией ДНК данной конструкции в мышечную объединённых общим происхождением мышей.
Материалы и способы
В качестве объекта исследования был избран клонированный фрагмент генома хантавируса серотипа PUU, кодирующий полноразмерный N белок, выделенный из нездоровых, погибших от ГЛПС во время вспышки 1997-1988 г.г. в г. Уфа. В опытах по ДНК_иммунизации употребляли нелинейных белоснежных мышей весом 18-20 г в возрасте 8-10 недель.
Для сотворения генетической конструкции, использованной для иммунизации мышей, применяли обычные методики (Sambrooketal., 1989). Генную иммунизацию проводили по последующей схеме. Плазмидную ДНК , выделенную и очищенную по обычной методике, вводили мышам в физиологическом растворе по 100 мкл в концентрации 2 мкг/мл в квадратичную тканью. Состоит из плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов) брали на 0, 3, 6, и 9 недельках опыта. На 10 недельке из мышечной ткани из места инъекции выделили геномную ДНК по методике описанной Д. Мерфи и Дж. Хэнсоном (Гловер и др., 1989). Амплификацию геномной ДНК проводили на многоканальном амплификаторе МС_2 (АО «ДНК_разработка«, Москва) в течение 40 циклов при температуре отжига 42°C. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по методике, изложенной в лабораторном руководстве Гловера с соавт. (Гловер и др., 1989).
Результаты
Фрагмент генома вируса PUU длиной 1302 п.н., кодирующий полноразмерный N вирусный белок, мы переклонировали из сделанной нами ранее плазмиды pGEM_TEasyS в вектор для транзиентной экспрессии pcDNA_3 по веб-сайтам для рестриктазы EcoRI. Опосля рестриктазного картирования и секвенирования был отобран клон pcDNA_3S с правильной ориентацией вставки относительно CMV промотора. Приобретенная система pcDNA-3S отвечает требованиям, предъявляемым для удачной ДНК -вакцинации (Smookeretal., 2004). Вектор pcDNA_3 содержит промотор цитомегаловируса, который обеспечивает высочайший уровень экспрессии клонированного гена в эукариотических клеточках, также сигнал полиаденилирования. Для выработки плазмиды в E. сoli в вектор включен прокариотический origin репликации. Не считая того, клонированная последовательность S-сегмента содержит инициирующий ATG и терминирующий TGA триплеты. Плазмидная ДНК данного клона дальше была применена нами для иммунизации лабораторных мышей. В качестве контроля употребляли вектор pcDNA_3, который вводили по той же схеме, что и pcDNA_3S. Сыворотка всех иммунизированных звериных, собранная до начала опыта, также через одну недельку опосля каждой инъекции была тестирована при помощи непрямого ИФА на присутствие вирус лихорадка
Таблица 1. Гуморальный ответ мышей, иммунизированных плазмидами pcDNA_3 (контроль) и pcDNA_3S, содержащей последовательность, кодирующую N белок вируса PUU
№ звериного
Введенная плазмида
Оптическая плотность, О.Е.
Сыворотка
д. и.*
Сыворотка
3 неделька п.п.и.
Сыворотка
6 неделька п.п.и.
Сыворотка 9 неделька п.п.и
1
pcDNA_3
0,641
0,484
0,364
0,298
2
pcDNA_3S
0,382
1,481
1,820
0,296
3
pcDNA_3S
0,275
2,127
1,593
0,751
4
pcDNA_3S
0,251
2,068
1,173
0,767
5
pcDNA_3S
0,370
2,116
0,883
1,944
6
pcDNA_3S
0,121
0,863
1,645
0,247
7
pcDNA_3S
0,685
1,08
0,752
0,718
8
pcDNA_3S
0,274
2,01
0,156
0,862
9
pcDNA_3S
0,413
1,483
1,503
1,616
Данные ИФА проявили, что внутримышечное введение экспрессирующего вектора pcDNA-3S, кодирующего ген белка N, вызывало у большинства иммунизированных звериных увеличение уровня иммуноглобулинов, что, видимо, соединено с синтезом N-части иммунизированных звериных не ясна.
Способом ПЦР было показано присутствие плазмиды pcDNA_3S в мышечной ткани иммунизированных мышей. Амплификация геномной ДНК , выделенной из веб-сайта инъекции с праймером, соответственном участку с 39 по 59 н. «+» цепи кДНК S_сегмента штамма CG_1820/Уфа_83 (ориентация «+») и праймером, комплементарным участку с 552 по 576 н. «+» цепи кДНК S_сегмента штамма CG_1820/Уфа_83, (ориентация «-«) выявила фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым и составил 537 п.н. (рис.1)
Рис.1. Электрофоретический анализ товаров ПЦР: 1—маркерные фрагменты ДНК фага л, расщепленные рестриктазой StyI; 2—амплификация геномной ДНК мыши, иммунизированной pcDNA 3; 3, 4, 5, 6—амплификация геномной ДНК мышей, иммунизированных pcDNA 3S
Таковым образом, мы предполагаем, что иммунизация мышей плазмидной конструкцией pcDNA-3S, содержащей последовательность, кодирующую белок N вируса серотипа PUU, под контролем CMV промотора, индуцирует эндогенный синтез антител против данного антигена. Различия в динамике N-системы мышей, так как нами использовались нелинейные мыши. Также приобретенные нами результаты свидетельствуют, что плазмида pcDNA-3S присутствовала в мышечной ткани иммунизированных звериных, по последней мере, в течение месяца опосля крайней инъекции.
Роль белка N в индукции защитного иммунитета против хантавирусов, вызывающих ГЛПС, остается плохо изученной. Ранее проведенные исследования проявили, что N-антитела не владеют нейтрализующей активностью (Hooperetal., 1999). Но в ряде работ говорилось, что иммунизация мышей рекомбинантным хантавирусным N белком, также ДНК -вакцинация звериных экспрессирующими векторами, несущими ген белка N патогенных хантавирусов защищало мышей в неких вариантах от предстоящего инфецирования ГЛПС (Ulrich etal., 1998; Buchtetal., 2001; Bharadwajetal., 2002). Потому, может быть, что белок N играет важную роль в индукции клеточного иммунитета против инфекции , вызываемой хантавирусами.
Таковым образом, в предстоящем нужно провести новейшие длительные опыты с целью найти, способна ли приобретенная нами система вызвать длительный иммунный ответ в звериных, также защитить их от инфицирования хантавирусом серотипа PUU.
Перечень литературы
1.Ivory C., Chadee K. DNA vaccines: designing strategies against parasitic infections // Gen.vaccines and therapy. — 2004. — V. 2 — P.17-45.
2.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning? A laboratory Manual, 2nd edn. — 1989. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor.
3.Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК . способы. М.: Мир, 1989. С. 346.
4.Фазлыева Р.М., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Геморрагическая лихорадка с почечным
]]>