(5 оценок, среднее: 4,80 из 5)
Загрузка...
Учебная работа. Анализ качественных и количественных характеристик антибиотиков
Содержание
Введение
- 2.1 Микробиологическое исследование лекарств
- 2.1.1 Способы разведений
- 2.1.2 Турбидиметрические способы
- 2.1.3 способы диффузии в агар
- 2.2 Определение отдельных составных частей лекарств
- 2.3 Хим и физико-химические способы определения лекарств
- 2.3.1 Хим способы
- 2.3.2 Оптические способы. Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете
- 2.3.3 Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете
- 2.3.4 Инфракрасная спектроскопия
- 2.3.5 Флюорометрия
- 2.3.6 Оптическое вращение
- 2.3.7 Химические способы
- 2.3.8 Полярография
- 2.3.9 Амперметрическое (полярометрическое) титрование
- 2.3.10 Кондуктометрия
- 2.3.11 Радиоактивные изотопы в анализе лекарств
- 2.4 Количественное определение неких лекарств
- 2.4.1 Пенициллин
- 2.4.2 Стрептомицин
- 2.4.3 Тетрациклины
- 2.4.4 Левомицетин
- 2.4.5 Эритромицин
- 2.4.6 Неомицин
- 2.4.7 Флоримицин
- 2.4.8 Грамицидин С
- 2.4.9 Циклосерин
Введение
Лекарства ? органические соединения, образуемые микробами и владеющие способностью в незначимых концентрациях избирательно тормозить рост остальных микробов либо убивать их. Это определение, справедливое в отношении большинства лекарств, не является, естественно, исчерпающим так, чтоб оно обхватывало все вещества, входящие в данную группу. Чтоб уточнить понятие «антибиотик», нужно дополнить его определение несколькими примечаниями.
1. Ряд микробов производит вещества, владеющие способностью тормозить рост остальных микробов, но, невзирая на это, они не могут быть причислены к лекарствам. Это, к примеру, органические кислоты, этиловый спирт, перекись водорода и некие остальные вещества, действие которых проявляется в существенно наиболее больших концентрациях, нежели у лекарств.
2. Посреди лекарств можно выделить также антибиотически активные вещества, получаемые из зелёных растений, так именуемые фитонциды. Сюда относятся, к примеру, хлорелин, аллицин, томатин, антибиотик из настурции (Tropaelum majus). Посреди лекарств в широком смысле слова можно выделить и антибиотически активные вещества звериного происхождения. Это, к примеру, экмолин ? продукт, получаемый из органов рыб и зарекомендовавший себя как средство для исцеления ряда болезней, также как средство, продлевающее действие пенициллина, стрептомицина и остальных лекарств. Иными примерами могут служить препараты, поучаемые из членистоногих, посреди которых, к примеру иридомирмецин, выделенный из экстракта 1-го из видов тропических муравьёв, имеет весьма широкий антимикробный диапазон и вприбавок владеет инсектицидным действием. В истинное время понятно весьма много лекарств, потому, чтоб легче ориентироваться, их нужно поделить на несколько групп.
3. Отдельные лекарства, которые сначало были обнаружены и выделены как продукты обмена определённых микробов, т.е. получены путём биосинтеза, можно получать и создавать также и способами хим органического синтеза. Эти лекарства, как следует, являются переходными меж фактически антибиотиками и химиотерапевтическими средствами. Химиотерапия в самом широком смысле слова есть исцеление хим субстанциями. В наиболее узеньком смысле слова химиотерапия есть исцеление заразных заболеваний хим субстанциями, что до этого всего подразумевает специфичное действие крайних на определённый вид либо целую группу патогенных бактерий.
Для того чтоб быть неплохим целебным средством, любой антисептик должен владеть несколькими главными качествами.
1. Антибиотик должен при низкой концентрации (не выше 10-50 мкг/мл) убивать болезненные мельчайшие организмы либо, по последней мере, останавливать их размножение. Другими словами, продукт должен владеть в весьма низкой концентрации антибактериальными либо хотя бы бактериостатическим действием.
2. Активность антибиотика против болезнетворных микробов не обязана сколько-нибудь значительно понижаться под действием жидкостей тела, как, к примеру, сыворотка крови (внутренней средой организма человека и животных), лимфа, гной
3. Действие на мельчайшие организмы обязано быть резвым. Болезнетворные мельчайшие организмы не должны получать устойчивость (резистентность) против антибиотика резвее, чем антибиотик подавит их размножение.
4. Антибиотик не должен ни в коей мере вредить макроорганизму (человеку). Он не должен владеть токсичностью ни конкретно опосля введения разовой дозы, ни хронически, т.е. опосля неоднократного введения в течение нескольких дней. Он не должен также наносить вред тканям макроорганизма при конкретном контакте с продуктам, к примеру при парентеральном внедрении.
5. Антибиотик не должен значительно снижать иммунологические реакции, а именно, нарушать образование антигенов, вырабатываемых организмом против болезнетворных бактерий. Равным образом продукт не должен нарушать фагоцитоз.
6. Антибиотик не должен препятствовать процессу излечения.
Обозначенными качествами разные лекарства владеют только до известной степени. Из всех используемых лекарств более много обозначенным выше требованиям удовлетворяет пенициллин. Применение лекарств в истинное время не ограничивается только областью медицины. Лекарства с большущим фуррором употребляют как добавки в корма сельскохозяйственных звериных, для исцеления болезней растений, как средства, предотвращающие инфицирование в бродильной, консервной и остальных отраслях индустрии. Пока ещё не ясно, какое пространство займут лекарства в качестве стимуляторов роста растений.
1. Высококачественное определение лекарств
задачка отменно найти неведомый антибиотик встаёт как при исследовании новейших лекарств, так и в практике, если необходимо показать присутствие антибиотика в лекарственных продуктах. Обе задачки требуют совсем разных способов. Самым надёжным способом идентификации антибиотика является определение его инфракрасного диапазона. Результаты тут полностью однозначны. Лишь опосля измерения инфракрасного диапазона можно с полной уверенностью судить о отличии либо идентичности 2-ух лекарств различного происхождения. Так как инфракрасным спектрофотометром вооружена не любая лаборатория, то для идентификации лекарств были разработаны системы обычных хим реакций, достаточно надёжных для идентификации узнаваемых лекарств.
Для резвого высококачественного определения лекарств в лекарственных продуктах весьма комфортна осциллографическая полярография. При отлично приготовленной аппаратуре можно за несколько минут идентифицировать большая часть сейчас используемых лекарств. Фактически более принципиальным являются разграничение тетрациклиновых лекарств от хлорамфеникола, также проверка состояния и чистоты пенициллиновых препаратов, причём принципиально стремительно установить, до какой степени продукт разложился. Иным резвым физическим способом идентификации лекарств является определение показателя преломления твёрдого вещества. В табл. 2 приведены величины характеристик преломления для обычно используемых лекарств в твёрдом состоянии.
Таблица 1 Список хим тестов для высококачественного определения антибиотика
Бацитрацин
Фумагиллин
Карбомицин
Эритромицин
Грамицидин
Тиротрицин
Полимиксин В
Виомицин
Неомицин
Тетрациклин
Окситетрациклин
Хлортетрациклин
Хлорамфеникол
Дигидрострептомицин
Стрептомицин В
Стрептомицин А
Эфинамн-пенициллин
Прокаин-пенициллин
Пенициллин G (К-соль)
тест
+
+
+
Гидроксиламин+FeCl3
+
+
Мальтольная реакция (на стрептозу)
+
+
+
+
Реакция Эльсона ? Моргана (на глюкозамин)
+
+
+
+
тест с реактивом Вебера (на гуанидиновую группу)
+
+
+
+
Нингидриновая реакция
+
+
Диазотация
+
+
тест с реактивом Эрлиха (пара-диэтиламино-бензальдегидом)
+
+
Ацетон+HCl
+
Ванилин+HCl
+
+
+
+
+
Биуретовая реакция
красноватый
красноватый
фиолет.
Концентрированная H2SO4
+
Ацетон+H2SO4
+
+
+
Флюоресценция в ультрафиолетовом свете
Таблица 2 Индексы преломления неких лекарств в твёрдом состоянии, определённые способом погружения
Антибиотик
Пенициллин-калиевая соль
Прокаинпенициллин
Стрептомицин-сульфат
Стрептомицин-хлоргидрат
Хлортетрациклин-хлоргидрат
Окситетрациклин-хлоргидрат
Бацитрацин
Полимиксин В (сульфат)
Эритромицин
1,57?1,58
1,57?1,58
1,55
1,56
1,66?1,67
1,55?1,56
1,54?1,55
1,53
1,45?1,47
Практическую Ценность представляет разница меж показателем преломления хлортетрациклина и окситетрациклина, на базе которой можно эти два антибиотика различить. Весьма специфичными являются микробиологические способы идентификации лекарств. Для этого используются штаммы, специфично резистентные к данному антибиотику, либо же так именуемые зависимые штаммы, т.е. такие, рост которых обоснован присутствием определяемого антибиотика. Этот способ в особенности надёжен, но изыскание либо выведение таковых штаммов является обычно весьма трудоёмким делом.
2. Количественное определение лекарств
В процессе производства требуется найти содержание антибиотика в культуральной воды в процессе ферментации, во всех промежных продуктах при выделении и чистке и, в конце концов, в готовом препарате. Для этого используют огромное количество самых различных био и хим способов.
количество лекарств выражают в так именуемых единицах деяния (ЕД). Определение единицы не идиентично для всех лекарств. У лекарств, которые были выделены в чистом виде, единица определяется как микрограмм незапятнанного вещества. К огорчению, тут нет единства, потому что у неких лекарств за единицу принимается микрограмм соли (к примеру, хлортетрациклин солянокислый), а у остальных ? микрограмм основания(к примеру, у стрептомицина).
Активность антибиотических препаратов в твёрдом состоянии выражается количеством единиц в 1 мг вещества. Содержание антибиотика в культуральной воды, в концентратах и смесях выражается числом единиц в 1 мл воды.
Количественное определение лекарств можно проводить как хим, так и микробиологическими способами. Главными преимуществами хим способов являются их быстрота и сравнимо высочайшая точность. Преимуществом же микробиологических способов является их намного большая специфика: посторонние примеси, находящиеся в испытуемых образчиках, не влияют в таковой степени на результаты, как это бывает при хим способах.
Микробиологически можно найти и содержание таковых лекарств, хим и физико-химические характеристики которых ещё тщательно неопознаны.
2.1 Микробиологическое исследование лекарств
Главным принципом микробиологических способов количественного определения активности антибиотика является определение степени задержки роста микроорганизма, чувствительного к данному антибиотику. Культуры либо бактерии, применяемые для данной для нас цели, именуются тест-культурами, либо тест-микробами. Задержка роста, вызванная определённым количеством применяемого материала с неведомым содержанием антибиотика (к примеру, культуральной воды, промежного продукта на стадии выделения лекарственно формы продукта и т. п.), сравнивается с задержкой роста тест-культуры, вызванной определённым, известным количеством данного антибиотика (эталоном).
Микробиологические способы определения активности лекарств можно в главном поделить на способы, при которых действие на тест-культуру исследуется на водянистой среде, и способы, при которых действие антибиотика на тест-культуру оценивается с применением твёрдой питательной среды. К первой группе относятся способы серийных разведений и турбидиметрические способы; ко 2-ой группе ? способы диффузии в агар на чашечках и способы диффузии в агар в капиллярах либо пробирках. Главными требованиями, которые нужно предъявлять к микробиологическим способам количественного определения лекарств, являются последующие.
1. Точность.
2. чувствительность.
3. Простота техники опыта.
4. Более куцее время инкубации.
Наиболее либо наименее совершенное выполнение всех этих требований зависит до этого всего от используемого способа. Для заслуги наибольшей чувствительности, не считая того, большую роль играет способы разведений
Принципом способов разведений является определение количества антибиотика, которое на сто процентов подавляет рост тест-культуры. При всем этом раствор анализируемого эталона с неведомым содержанием антибиотика и раствор эталона с известным содержанием антибиотика разводят в геометрической прогрессии питательной средой, за ранее засеянной тест-культурой. По истечении нужного времени инкубации определяют наибольшее разведение эталона и эталона, которое ещё подавляет рост тест-культуры. Путём сопоставления этих разведений вычисляют активность исследуемого эталона. Вследствие того что оценку проводят по высококачественному признаку («растёт»-«не растёт»), этот способ не удовлетворяет первому из вышеперечисленных требований. совместно с тем основным преимуществом способов разведений является их высочайшая чувствительность, возможность определять весьма малые количества лекарств, а в неких вариантах — и куцее время (около 3 часов), нужное для получения результатов.
При определении содержания лекарств в жидкостях тела способом серийных разведений можно применять индикаторы, реагирующие на изменение рН либо окислительно-восстановительного потенциала в процессе роста тест-микроба, к примеру бромкрезоловый красноватый, метиленовый голубий, тимоловый голубий, аква голубий либо феноловый красноватый и др.
2.1.2 Турбидиметрические способы
Турбидиметрические способы, как и способы разведений, обычно удовлетворяют требованиям, обозначенным в пп. 2-4, но при всем этом их точность по сопоставлению с способами разведений существенно выше ввиду способности непрерывного проведения количественных измерений.
Принципом, на котором основаны эти способы, является измерение задержки роста тест-организма, проявляющейся в большем либо наименьшем помутнении питательной среды. Для измерения помутнения употребляют фотоэлектрические нефелометры. Путём сопоставления интенсивности задержки роста, вызванной действием неведомого количества антибиотика со обычной кривой, выражающей степень задержки, вызываемой известными количествами антибиотика, создают вычисление активности анализируемого эталона. Турбидиметрические способы по сопоставлению с способами диффузии обычно являются сравнимо наименее точными, потому что мельчайший организм, возрастающий на водянистых питательных средах, при рабочих критериях проведения анализа наиболее чувствителен к изменчивым факторам наружной среды.
На итог могут воздействовать и некие сопутствующие вещества, находящиеся в испытуемом образчике; при способах диффузии воздействие этих веществ вследствие их наименьшего проникания в агар устраняется. Этими субстанциями являются, к примеру, жирные кислоты либо глюкозодегидрогеназа. Эти способы недозволено использовать для определения активности лекарств в образчиках, которые являются или окрашенными, или дают мутный раствор, если лишь это явление недозволено убрать путём соответственной обработки эталона.
Источником ошибок могут быть и конечные, неспецифические конфигурации расцветки культуры либо конфигурации помутнения, которые могут произойти, к примеру вследствие конфигурации рН при выращивании микробов. Невзирая на это, но, турбидиметрические способы используются очень обширно, основным образом поэтому, что по сопоставлению с способами диффузии в агар они требуют существенно наименьшего времени инкубации.
2.1.3 Способы диффузии в агар
При производстве и разработке технологии получения лекарств, пожалуй, более нередко используют способы диффузии в агар, которые по сопоставлению с прошлыми 2-мя способами обеспечивают огромную точность результатов. В неких модификациях при помощи этих способов можно определять даже толики микрограмма антибиотика. Их недочет заключается в том, что они требуют относительно долгого времени инкубации (приблизительно 18 часов). По сопоставлению с турбидиметрическими способами способы диффузии являются наиболее прибыльными также и поэтому, что они обычно требуют меньше места для инкубации.
способы диффузии в агар на чашечках основаны на том, что антибиотик диффундирует из испытуемого эталона в питательную агаровую среду, засеянную чувствительной к данному антибиотику культурой. Вокруг эталона появляется круглая зона, в границах которой тест-культура не растёт. Начало этому способу положила оксфордская группа исследователей, которая разработала так именуемый способ с цилиндриками. По этому раствор антибиотика (эталона и эталона) заливают в полые цилиндрики, помещённые на поверхность засеянной тест-микробами агаровой среды в чашечках Петри. Определение активности создают путём сопоставления величин зон задержки роста у эталона и эталона при одном и том же разведении.
При способах диффузии в агар на чашечках образующиеся зоны задержки не являются буквально круглыми, и, как следует, измерение их поперечника в различных направлениях даёт непостоянные и тем недостаточно четкие результаты. От этого недочета свободны линейные способы диффузии, при которых измеряется задержка роста, получавшаяся вследствие диффузии раствора антибиотика только в одном измерении. При этих способах раствор антибиотика или наливают на засеянную тест-микробами питательную среду в пробирке, или засеянную питательную среду насасывают в стеклянные капилляры, которые погружают потом в раствор антибиотика. Рост и тут быть может выявлен вследствие гемолиза либо конфигурации расцветки индикатора, добавленного к агаровой питательной среде. Весь процесс быть может в ряде операций механизирован и автоматизирован.
При изготовлении смесей испытуемого эталона и эталона для количественного определения лекарств способами диффузии существенно наиболее серьёзной задачей является выбор жидкостей, используемых для растворения. Обычно для растворения эталона и эталона используют фосфатные буферные смеси, рН которых выбирают так, чтоб разложение антибиотика было как можно наименьшим, а тест-культура была более чувствительной. Для стрептомицина, к примеру, выбирают буфер с рН>7,0, для пенициллина и тетрациклиновых лекарств — буфер с рН<7,0.
В согласовании с сиим устанавливают и рН применяемой для определения агаровой питательной среды. Тут, но, необходимо подразумевать, что рН среды влияет на рост тест-организма и что фосфатные анионы оказывают стабилизирующее действие на смеси пенициллина.
Особенной неувязкой микробиологического определения активности лекарств является определение отдельных лекарств в консистенциях способом, хорошим от хроматографического. Эта неувязка появилась в первый раз, когда необходимо было определять отдельные пенициллины относительно друг друга. Ввиду того что активность отдельных пенициллинов различна при испытании с различными культурами, можно, не считая хроматографического способа, применять и так называемое дифференциальное титрование, при котором эталон, содержащий смесь пенициллинов, титруют или турбедиметрическим, или способом диффузии в агар с внедрением нескольких разных тест-организмов. Присутствие отдельных пенициллинов в консистенции потом рассчитывают на основании соотношения известной активности отдельных пенициллинов против отдельных тест-культур. При определении содержания пенициллина и стрептомицина в фармацевтических формах, содержащих смесь этих лекарств, можно или инактивировать пенициллин при помощи пенициллиназы, или найти пенициллин с микроорганизмом, устойчивым к пенициллину. Подобные же способы используют и при определении остальных лекарств в консистенциях.
2.2 Определение отдельных составных частей лекарств
Почти все лекарства, как, к примеру, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически персональными субстанциями, а представляют собой смесь нескольких структурно схожих веществ. Картонная хроматография и электрофорез на бумаге разрешают выделить эти составные части и отделить их количественно.
Для исследования лекарств можно использовать нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от хим природы антибиотика.
Зоны отдельных лекарств выявляются на хроматограммах либо электрофотограммах почаще всего биоавтографически, т. е. способом, схожим определению антимикробной активности лекарств чашечным способом. Хроматограмму на узенькой полоске фильтровальной бумаги опосля её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37?. В процессе инкубации микроорганизм, посеянный на агар, растет, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, но, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются незапятнанные прозрачные округленные зоны, которые с первого же взора указывают на размещение антибиотически активных составных частей начальной консистенции. Измеряя поперечник прозрачной зоны, можно установить и количество соответственной составной части путём сопоставления этого поперечника с поперечником зоны эталона, хроматографируемого сразу с анализируемыми эталонами.
Этот способ используют для обнаружения лекарств и витаминов с той только различием, что витамины (группа низкомолекулярных органических соединений относительно простого строения и разнообразной химической природы) выявляются положительно, т. е. микроорганизм растёт только в местах, где имеется витамин (низкомолекулярное органическое соединение относительно простого строения, ноебходимое для всего живого). Основным достоинством биоавтографии является её чувствительность, которая существенно превосходит чувствительность всех цветных реакций. В этом с нею сравним только способ флюоресценции. Это, но, не гласит о том, что при хроматографировании лекарств для их обнаружения не используют цветные реакции при помощи хим веществ. Этот метод используют тогда, когда желают найти составную часть антибиотика, химически схожую ему, но на биологическом уровне неактивную.
В табл. 3 приведены главные методы хроматографии более употребительных лекарств. Если же эталон, кроме антибиотика, содержит ещё огромное количество солей либо других примесей, то картонная хроматография может и не отдать не плохих результатов. В этих вариантах можно прибегнуть к электрофорезу га бумаге либо же соединять электрофорез с хроматографией.
Таблица 3 Картонная хроматография лекарств
Антибиотик
Пропитка бумаги
Система растворителей
Проявление
порядок следования составных частей
Пенициллины
Фосфатный буфер (рН=6,5)
Диэтиловый эфир
Биоавтография (B. Sublitis), (PC-220)
X, G, G, дигидро-F, K
Пенициллины (как гидроксамовые кислоты)
Изопропиловый эфир ? изопропанол
Хлорное железо
Стрептомицин
н-Бутанол-пара-толуол-сульфоновая кислота (2%)
Биография
Реакция Сакагуши
Реактив Вебера
Псевдострептомицин; дигидрострептомицин; стрептомицин В; стрептомицин А
Хлорамфеникол
Al2O3
Бензол ? метанол ? вода (2:1:1)
15% хлорид олова в HCl, потом парадиметил-аминобензальдегид
Хлорамфеникол и разные побочные продукты синтеза
Хлортетрациклин и тетрациклин
?
н-Бутанол ? уксусная кислота ? вода (4:1:5)
Биоавтография (B. subtilis) (жёлтая флюоресценция в ультрафиолето-вых лучах )
Тетрациклин, хлортетрациклин
Тетрациклиновые лекарства
Фосфатный буфер (рН=3,0)
Этилацетат
Биоавтография.
Парадиметиламинобензальдегид
Тетрациклин
Окситетрациклин
Хлортетрациклин
Эритромицин
?
Метанол ? ацетон ? вода (19:6:75)
Биоавтография
Эритромицин В
Эритромицин
Актиномицин
?
н-Дибутиловый эфир, эфир-этилацетат ? 2%, аква паратолуолсульфоновая кислота
Реактив Несслера
?
Картонная хроматография и электрофорез неподменны при контроле процесса получения лекарств путём ферментации. Их основным достоинством будет то, что они идиентично отлично подходящи как для неочищенных смесей, так и для очищенных веществ. Это обосновано до этого всего спецификой биоавтографического способа. Ещё большее 2.3 Хим и физико-химические способы определения лекарств
2.3.1 Хим способы
Хим способы употребляются для анализа лекарств весьма изредка. Фактически это будет только несколько способов, используемых для пенициллина. Они основаны на поглощении йода продуктами гидролиза пенициллина. Эти способы в разных модификациях используются в практике при контроле ферментации и экстракции пенициллина. При наиболее древнем методе с применением щелочного гидролиза нужно было экстрагировать пенициллин из культуральной воды амилацетатом при рН=2,0 и температуре 0?, потом из амилацетата экстрагировать его фосфатным буфером при рН=7,8 и лишь с сиим экстрактом создавать конкретное йодометрическое определение. Наиболее новейший способ, про котором пенициллин разрушается кислотой, дозволяет проводить работу прямо с культуральной жидкостью без экстракций.
Пенициллин можно определять также ацидометрически опосля его расщепления до пенициллоиновой кислоты, при всем этом из в-лактамного кольца пенициллина освобождается одна вольная карбоксильная группа, которую можно титровать; в-лактамное кольцо пенициллина можно расщепить или щёлочью, или пенициллиназой. Этот способ, но, недозволено использовать для нативного раствора, который содержит огромное количество сторонних веществ, делающих четкое ацидометрическое титрование неосуществимым.
2.3.2 Оптические способы. Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете
Сюда относятся более нередко используемые способы количественного определения лекарств. Главным достоинством колориметрических способов определения являются их простота, скорость и сравнимо высочайшая точность, недочетом ? их малая специфика.
Для колориметрического определения лекарства превращают в окрашенные производные. При всем этом употребляют цветные реакции или с самими антибиотиками, или с продуктами их расщепления. к примеру, тетрациклиновые лекарства образуют окрашенные комплексы с хлорным железом в кислой среде. Стрептомицин расщепляют едким натром до мальтола, который даёт цветную реакцию с хлорным железом либо с реактивом Фелинга. Лекарства группы фенола либо ароматичных аминов со вольным орто- либо пара-положением можно обычно перевести в азокрасителе путём реакции с диазониевыми солями. Так можно определять, к примеру, тетрациклиновые лекарства.
Некие лекарства можно перевести в соединения с любым красителем, потом выделить эти вещества из обскурантистской консистенции и найти колориметрически. Так можно определять пенициллин при помощи N-(1-нафтил-4-азобензол)-этилендиамина.
2.3.3 Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете
Спектральный анализ имеет огромные способности, нежели колориметрия. Большинству лекарств свойствен соответствующий диапазон поглощения в ультрафиолетовой области, и потому определять их спектрофотометрически можно конкретно. Недочетом будет то, что присутствие сторонних веществ мешает определению в существенно большей мере, нежели при колориметрии либо спектрофотометрии в видимом свете, и потому определять лекарства сиим способом можно только в раздельно незапятнанных образчиках.
Можно повысить специфика способа и создать его применимым к наименее незапятнанным продуктам путём измерения экстинкции при 2-ух разных длинах волн, из которых одна находится на максимуме, а иная ? при примыкающем минимуме кривой экстинкции антибиотика. Сиим путём часто удаётся установить воздействие среды. Принципиально, чтоб все измерения проводились при строго определённом рН, так как диапазон поглощения антибиотика в ультрафиолетовом свете весьма очень зависит от рН среды.
2.3.4 Инфракрасная спектроскопия
Этот способ является специфическим для высококачественного определения антибиотика. Его можно, но, весьма отлично применять и для количественного определения. Обычно достигается точность, равная точности спектрофотометрии в ультрафиолетовом свете, а в неких вариантах даже ещё наиболее высочайшая (±1%). Можно создавать количественный анализ как смесей, так и твёрдых веществ. При анализе веществ в смесях нужно избрать пригодный растворитель, который сам бы не всасывал инфракрасные лучи в данной области. Обычно это бывает сероуглерод либо же галоидопроизводные углеводородов. Потому антибиотик необходимо иметь в таковой форме, чтоб его можно было в этих субстанциях растворить. Если же пригодный растворитель отыскать не удаётся, можно провести спектрофотометрическое определение вещества в твёрдом состоянии. Твёрдые вещества или таблетируют с бромистым натрием. Или суспендируют в масле: измерение поглощения создают в тонких слоях данной для нас суспензии.
Для количественного определения нужно знать плотность слоёв данной для нас суспензии. Её определяют путём прибавления известного количества кристаллического вещества, к примеру б-аланина, к суспензии антибиотика и измерения экстинкции при одном из максимумов поглощения добавленного вещества.
2.3.5 Флюорометрия
Это один из более чувствительных способов определения лекарств, приближающийся по собственной чувствительности к биологическим способам. Главной областью его внедрения являются тетрациклиновые лекарства, которые сами по для себя флюоресцируют жёлтым светом в умеренной щелочной среде; но обычно измеряется голубая флюоресценция их товаров разложения (в щелочной среде). Хлортетрациклин инактивируют щелочами, к примеру 0,2 М тринатрийфосфатом, оставив смесь стоять в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тетрациклин кипятят при всем этом в течение наиболее длительного времени.
Лекарства, которые сами по для себя не флюоресцируют и не образуют флюоресцирующих товаров разложения, можно тем не мене определять флюорометрически путём соединения с пригодным флюоресцирующим веществом и выделения пригодного доп соединения.
микробиологический антибиотик пенициллин спектрофотометрия
2.3.6 Оптическое вращение
Поляриметрические способы дают весьма надёжные результаты применительно к концентратам оптически активных лекарств, если лишь они не очень очень покрашены. Вследствие удобства работы они получили весьма обширное применение как обыденные способы контроля, в индивидуальности при выделении стрептомицина. Для определения лекарств в культуральной воды они непригодны, так как в этих вариантах они малочувствительны.
Сконструирован автоматический регистрирующий поляриметр, с помощью которого исследована кинетика разрушения пенициллина кислотами.
2.3.7 Химические способы
Лекарства, являющиеся кислота либо основаниями, можно титровать потенциометрически. Эти способы используют сравнимо изредка, так как с таковыми антибиотиками изредка приходится иметь дело в этих формах. Исключение составляет, к примеру, пенициллин.
Хлоргидраты тетрациклиновых лекарств имеют очень кислотные характеристики, напротив, основность этих лекарств весьма слаба. Потому хлоргидраты можно титровать конкретно алкалиметрически. Опосля подтитровки хлоргидрата (заслуги степени диссоциации вольной амфотерной формы антибиотика) на кривой потенциометрического титрования можно ясно созидать резкое изменение потенциала.
Намного огромную точность и существенно наиболее широкие способности имеет потенциометрическое титрование в неводных растворителях. Так, к примеру, слабоосновные лекарства, как тетрациклины, также эритромицин и карбомицин, можно определять при помощи титрованного раствора хлористой кислоты в диоксане. Напротив, лекарства с кислотными качествами, пусть даже и весьма слабенькими, удаётся титровать в среде безводных оснований, к примеру, в триэтаноламине.
Эти способы прибыльны тем, что они являются всепригодными для целой группы лекарств. естественно, они могут применяться только только для незапятнанных веществ и готовых препаратов.
2.3.8 Полярография
Лекарства, содержащие в собственной молекуле восстанавливающиеся группы (к примеру, нитрогруппы, кетогруппы, примыкающие к одной либо наиболее двойной связи, альдегидные группы, карбоксильные группы, примыкающие к двойным связям) или имеющие хиноподобную структуру, могут быть восстановлены на ртутном капельном электроде и могут потому определяться полярографически. Сюда относятся до этого всего хлорамникол, дальше ? все тетрациклиновые лекарства, стрептомицин, все хиноновые лекарства, цитринин и туяплацины.
Остальные лекарства, напротив, окисляются на ртутном капельном электроде и могут потому давать анодную волну, которая также может служить для их количественного определения. Примером является гентизиловый спирт, производное гидрохинона.
Лекарства, которые сами по для себя полярографически неактивны, можно перевести несколькими методами в полярографически активные вещества. Так, к примеру, пенициллин гидролизуется поначалу щёлочью либо пенициллиназой и дальше в кислой среде ? до диметилцистеина. Эта аминокислота, содержащая группу ? SH, даёт отлично измеряемую волну в кобальтовом растворе Брдички.
Весьма ценна с аналитической точки зрения полярография хлорамникола. Этот антибиотик можно количественно определять полярографическим способом в био материале, как-то: в крови (внутренней средой организма человека и животных) и моче человека, в кутьтуральной воды.
Последующей областью внедрения полярографии являются тетрациклиновые лекарства. Их можно определять количественно в готовых продуктах и в фармацестических продуктах. При соответственном выборе среды можно определять количественно соотношение хлортетрациклина и окситетрациклина. Но количественный анализ консистенции хлортетрациклин и окситетрациклина идеальнее всего удаётся колориметрическим способом. В культуральной воды тетрациклиновые лекарства найти недозволено, так как в этом случае определению мешает выделение водорода, катализируемое белками и иными субстанциями, присутствующими в фильтрате культуральной воды.
2.3.9 Амперметрическое (полярометрическое) титрование
Любой антибиотик, который осаждается полярографически активными субстанциями, можно титровать амперметрически. Определение это является наиболее четким, но существенно менен специфическим, чем рядовая конкретная полярография. Эти способы по сей день применялись весьма не достаточно.
2.3.10 Кондуктометрия
Для прямого определения активности антибиотических препаратов можно применять кондуктометрическое титрование. Этот способ до сих пор применялся весьма не достаточно, хотя непременно, что на его базе может быть со временем обогатить анализ лекарств несколькими точными микроопределениями. Почаще кондуктометрия употребляется для определения зольности готовых антибиотических препаратов или для контроля десорбции лекарств из ионообменных колонн (в особенности стрептомицина).
2.3.11 Радиоактивные изотопы в анализе лекарств
В области лекарств сфера применении радиоактивных и тяжёлых изотопов необыкновенно широка. Меченые препараты можно идиентично обширно использовать как для аналитического контроля производства, так и для решения главных заморочек деяния лекарств на мельчайший организм и макроорганизм, для разъяснения устройств всасывания, циркуляции, скопления и выделения лекарств в теле. В области фармакологии и биохимии лекарств при помощи изотопов были достигнуты ценные результаты.
Изготовление антибиотика, меченного изотопом, делается в процессе биосинтеза путём, в общем схожим с получением обыденного антибиотика. Возможность специфичной метки (т. е. локализации изотопа в одном определённом, заблаговременно известном месте молекулы антибиотика) имеется только тогда, когда буквально известен предшественник антибиотика и когда этот предшественник можно специфично пометить. Таковая возможность имеется у бензилпенициллина, предшественник которого ? фенилуксусная кислота с любым изотопом углерода в карбоксильной группе ? просто доступен. Если сейчас при ферментации мы введём в качестве предшественника меченную таковым образом фенилуксусную кислоту, то мы получим специфично меченный пенициллин.
Определение лекарств с помощью препаратов, меченных изотопами, проводят обычно способом разбавления изотопов. Этот метод применим для анализа эталона хоть какой хим природы, если лишь из него можно получить хотя бы маленькое количество незапятнанного антибиотика. К примеру, к культуральной воды добавляют заблаговременно известное количество незапятнанного меченого антибиотика с известной удельной радиоактивностью. При всем этом меченый продукт в определённой степени разбавляют антибиотиком, содержащимся в образчике. Потом из воды выделяют антибиотик и несколько раз перекристаллизовывают до повсевременно удельной радиоактивности. Так как изотопы недозволено найти ординарными физическими способами, степень разбавления меченого продукта, содержащегося и в выделенном антибиотике, также его удельная радиоактивность будут назад пропорциональны содержанию антибиотика в культуральной воды.
2.4 Количественное определение неких лекарств
2.4.1 Пенициллин
Йодометрический способ
Под воздействием щелочей либо пенициллиназы происходит раскрытие бета-лактамного кольца в структуре антибиотика с образованием пенициллоиновой кислоты. Крайняя и реагирует с йодом. По разности йода, израсходованного на взаимодействие с пенициллином до и опосля гидролиза молекулы антибиотика, судят о количестве продукта в исследуемых образчиках.
Этот способ даёт отлично совпадающие результаты с данными био способов определения активности, и он применим для большинства фармацевтических форм пенициллина.
Взвешивают 25-30 мг исследуемого эталона антибиотика и растворяют в фосфатном буфере (рН 6,0) до получения концентрации приблизительно 2000 ЕД/мл. По 2 мл приобретенного раствора заносят в две 125-миллилитровые пробирки Эрленмейера. В первую из их добавляют 2 мл 1N раствора едкого натра и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Опосля этого в данную пробирку заносят 2 мл 1,2 N раствора соляной кислоты и 10 мл 0,01 N йода. Через 15 мин излишек йода оттитровывают 0,01 N веществом гипосульфита натрия. В конце титрования добавляют 1 каплю раствора крахмала и продолжают титрование при энергичном встряхивании до обесцвечивания голубой расцветки крахмала.
Во вторую пробирку добавляют 10 мл 0,01 N раствора йода и титруют сходу 0,01 N веществом гипосульфита натрия (контроль).
Активность пенициллина определяют по нижеприведённой формуле:
где У ? количество ЕД пенициллина в 1 мг;
a ? разность в титрах;
b ? активность рабочего эталона в ЕД/мг;
c ? вес эталона, мг;
F ? количество мл 0,01N раствора йода, поглощённого 1 мл рабочего эталона натриевой соли бензилпенициллина.
Следует держать в голове, что расход йода при титровании зависит от температуры, рН среды, концентрации йода и остальных обстоятельств. Потому нужно строго соблюдать условия стандартности опытов, тогда результаты будут постоянно воспроизводимыми.
Весовой способ определения бензилпенициллина
Этот способ является приблизительным, потому что нрав и количество осадка зависят от критерий осаждения.
Бензилпенициллин с N-этилпиперидином образует кристаллические соли, плохо растворимые в консистенции ацетил-ацетона и при определённой концентрации выпадающие из раствора в виде осадка. Это дозволяет найти пенициллин G не только лишь в виде кристаллической натриевой соли, да и в консистенции с иными солями пенициллина. способ не подходящ для определения пенициллина G в консистенции с пенициллином X.
способ ультрафиолетовой спектрофотометрии
Фенильная группа в пенициллине G дозволяет получать соответствующий максимум поглощения в ультрафиолетовом свете при 263 нм.
Хроматографичевкий способ
Смесь пенициллинов довольно чётко делится на полосках хроматографической бумаги. Проявление местоположения их осуществляется по зонам задержки роста тест-микроба вокруг определённых участков полосы, наложенной на микробный газон.
способ производится последующим образом.
Полосы хроматографической бумаги (35?0,5 см) пропитываются веществом фосфатного буфера (рН 6,8), представляющего смесь насыщенных смесей дигидрофосфатов калия и натрия, и подсушивают меж слоями фильтровальной бумаги при окончательном досушивании на воздухе. На линию старта наносят по 1-2 мл испытуемого раствора с начальной концентрацией 800-1000 ЕД/мл. Бумагу помещают в хроматографическую банку, в лоток которой налит освобождённый от перекисей эфир, насыщенный водой (нисходящая хроматография). Банку ставят в рефрижератор на день. Опосля этого бумажную ленту отрезают на 0,5 см выше полосы старта и переносят на засеянные тест-микробами лотки. Лента обязана плотно прилегать к агару. Лотки оставляют в термостате (37?) на 16-18 ч и потом читают результаты. количество зон задержки роста культуры соответствует числу типов пенициллинов, а порядок чередования их на картонной ленте зависит от коэффициента распределения. Более подвижен пенициллин К (гептилпенициллин), за ним поочередно размещаются дигидропенициллин F (амилпенициллин), пенициллин F (2-пентенилпенициллин), пенициллин G (бензилпенициллин) и пенициллин Х (пара-оксибензилпенициллин0.
Чем больше зона задержки роста, тем больше в консистенции того либо другого типа антибиотика, количество которого можно найти последующим образом: отрезанную бумажную ленту разрезают по длине на две равные части, одну из которых помещают на агар с тест-культурой, а вторую через 16-18 ч разрезают на части соответственно зонам задержки роста. Пенициллин из обрезков извлекают водой и водные экстракты титруют чашечным способом.
Этот метод наименее точен, чем описанный ранее диффузионный, а потому его следует расценивать только как приблизительный. Тем не наименее высококачественное определение пенициллинов хроматографическим способом всераспространено обширно.
2.4.2 Стрептомицин
Мальтольный способ
Сиим способом может быть определение не только лишь стрептомицина, да и маннозидстрептомицина. Он основан на том, что оба нареченных антибиотика при нагревании с веществом разбавленной щёлочи образуют мальтол, который определяется потом колориметрически либо спектрофотометрически по расцветке, образуемой им с солями железа либо реактивом фолина.
В мерную пробирку на 25 мл наливают 10 мл испытуемого эталона стрептомицина-основания, содержащего 0,5 мл антибиотика и 1 мг раствора. В эту же пробирку добавляют 2 мл 1 N NaOH и ставят её на кипящую водяную баню на 10 мин. Потом охлаждают пробирку в ледяной либо проточной водопроводной воде и приливают 2 мл 1,2 N HCl; добавляют 5 мл 0,25% хлористого железа и доводят общий объём консистенции дистиллированной водой до метки.
Приобретенный окрашенный раствор калориметрируют при 550 нм в соответственном фотоэлектрокалориметре против раствора обычного эталона антибиотика и дистиллированной воды в контролях.
Результаты выражают графически на полулогарифмической сетке, где по оси ординат откладывают значения для степени прохождения света, а по оси абсцисс ? концентрацию стрептомицина. Активность испытуемого эталона вычисляют по обычной кривой.
Недочеты способа: недозволено определять стрептомицин и маннозидстрептомицин раздельно при нахождении их в консистенции; если в крайней будет ещё и оксистрептомицин, то он в критериях опыта даст оксимальтол, который также образует окрашенные продукты с солями железа.
Нитропруссидный способ
Сиим способом можно определять разные стрептомицины, потому что понятно, что нитропруссид натрия в щелочной среде даёт окрашивание с гуанидином.
Определение производится последующим образов: соединяют равные объёмы 10% смесей нитропруссида натрия, железистосинеродистого калия и едкого натра. К консистенции приливают 3 объёма воды. Через 30 мин раствор готов к употреблению (он имеет ярко-жёлтую расцветку). При возникновении мути в растворе его подменяют свежайшим. Обычно реактив подходящ для работы только в течение нескольких часов.
К 5 мл раствора стрептомицина (концентрация 20-25 Ед/мл) приливают 1 мл реактива. При всем этом возникает устойчивая оранжевая расцветка. Раствор калриметрируют против раствора обычного эталона стрептомицина (контроль). Крайний должен быть прозрачным, так как мутные смеси могут исказить результаты определения.
Способ не полностью специфичен, потому что окрашенные соединения получаются и с иными субстанциями, содержащими гуанидиновые группы, и, а именно со стрептидином ? продуктом расщепления стрептомицина, не владеющим био активностью.
Микроманометрический способ
Способ применим для определения низких концентраций антибиотика (0,005-0,05 ЕД/мл).
В сосудики от аппарата Варбурга вносится взвесь 16-18-часовой культуры золотистого стафилококка 209Р (25-100 млн. клеток/мл), мясо-пентонный бульон без NaCl и глюкозы; рН среды 8,0. Объём консистенции в любом сосудике должен быть равен 2 мл. В центральную часть сосудика наливают 0,2 мл 1 N раствора NaOH. температура водяной бани ? 37?. Стрептомицин употребляется в концентрациях от 0,005 до 0,05 ЕД/мл. При всем этом меж количеством поглощённого микробами кислорода и концентрацией стрептомицина существует прямолинейная зависимость. Измерение дыхания проводят в границах 2,5 ч с интервалом измерений объёма поглощённого кислорода через любые 15-30 мин. По результатам опытов строят обычную кривую, на основании которой создают расчёт активности в испытуемом образчике. Для этого по оси ординат откладываколичество (мм3) поглощённого кислорода за 2,5 ч, а по оси абсцисс ? концентрацию антибиотика (ЕД/мл).
Необходимо подчеркнуть, что смеси стрептомицина наиболее высочайшей концентрации, чем 0,05 ЕД/мл, нужно за ранее разбавлять до концентрации 0,005-0,05 ЕД/мл либо определять иными способами.
Микроманометрическое определение годно для выявления концентрации стрептомицина в негемолизированной крови (внутренней средой организма человека и животных) (гемолизированная тканью. Состоит из плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур: эритроцитов и тромбоцитов) убивает стафилококка).
2.4.3 Тетрациклины
Колориметрический способ
Фенольно-гидроксильные группы в структуре хлортетрациклина, окситетрациклина и тетрациклина разрешают применять цветную реакцию их с хлорным железом для количественного определения нареченных лекарств.
В пробирку Эйленмейера (объёмом 50 мл) заносят 10 мл раствора испытуемого продукта ? основания, приготовленного путём растворения крайнего в 0,01 N HCl и содержащего 0,1 мг антибиотика в 1 мл. В эту же пробирку наливают 10 мл 0,05% раствора хлорного железа, перемешивают и оставляют при 16-18? на 10 мин, опосля что определяют прохождение света для эталона и испытуемого продукта при 490 нм на ФЭК против 0,01 n раствора соляной кислоты (контроль).
По данным анализа для смесей эталона строят обычную кривую на полулогарифмической сетке (по оси ординат откладывают характеристики колориметра, а по оси абсцисс ? концентрацию антибиотика-основания). По данной для нас кривой определяют количество антибиотика в испытуемом образчике. Схожим способом может быть определение хлортетрациклина и тетрациклина, приобретающих стойкую жёлтую расцветку при нагревании с соляной кислотой. Окситетрациклин таковой реакции не даёт.
Спектрофотометрический способ
Смеси окситетрациклина и тетрациклина дают жёлтое окрашивание при добавлении щёлочи. При всем этом наибольшее поглощение выявляется при 380 нм. Хлортетрациклин при обработке щёлочью даёт нестойкое жёлтое окрашивание и, по существу, не удаётся выявить максимум при 380 нм. Как следует, данный способ дозволяет определять окситетрациклин и тетрациклин в присутствии хлортетрациклина.
Описаны и остальные способы определения тетрациклинов и, а именно, хроматографические, флуорометрический и пр.
2.4.4 Левомицетин
способ диазотирования с следующим титрованием 0,1 М веществом нитрита натрия (ГФХ).
Берут точную навеску продукта (0,5 г) и помещают её в коническую пробирку на 250 мл, приливают 20 мл концентрированной соляной кислоты и осторожно, маленькими порциями, 5 г цинковой пыли. Потом приливают ещё 10 мл той же кислоты, обмывая стены пробирки, и опосля полного растворения цинковой пыли (можно подогреть), раствор количественно переносят в стакан для диазотирования, охлаждаемой снаружи льдом; добавляют 3 г бромида калия и медлительно титруют 0,1 M веществом нитрита натрия. Титрование считают законченным, когда капля воды, взятая через 3 мин опосля добавления раствора нитрита натрия, будет вызывать незамедлительное посинение йодкрахмальной бумаги; 1 мл 0,1 М раствора NaNO2 соответствует 0,03231 г левомицетина.
Колориметрический способ
Этот способ основан на восстановлении нитрогруппы левомицетина в аминогруппу, которая при диазотировании образует окрашенные соединения.
В пробирку Эрленмейера на 10 мл заносят 2 мл раствора испытуемого эталона в дистиллированной воде, содержащего 15 мкг антибиотика в 1 мл. Потом добавляют 1 мл 0,3 N NaOH и 25 мг NaHSO3. Приобретенный раствор оставляют при 16-18? в течение 15 мин. Спустя обозначенный срок в пробирку приливают 0,5 мл 5 % раствора NaNO2 и 5-10 капель концентрированной (36-37%) соляной кислоты. Через 1-3 мин добавляют 1 мл 5% раствора сульфаминовой кислоты. Образующиеся в пробирке азотистые пары убирают при помощи водоструйного насоса в течение нескольких секунд. Потом приливают0,5 мл 0,5% раствора N-(1-нафтил)-дихлордиэтилендиамина и доводят объём дистиллированной водой до метки. Через 2 ч создают замеры на ФЭК при 558 нм против дистиллированной воды, обработанной вышеуказанным методом (контроль).
Концентрацию испытуемого эталона определяют по обычной кривой на полулогарифмической сетке.
Обозначенный способ почаще употребляется при определении хлорамникола, получаемого ферментативным путём.
2.4.5 Эритромицин
Спектрофотометрический способ
Этот способ дозволяет определять эритромицин даже в присутствии товаров его кислой инактивации (в отличие от колориметрических способов). Он основан на измерении оптической плотности раствора эритромицина при 236 нм опосля слабенькой щелочной обработки. Для внесения поправки на поглащение света разными примесями и продуктами разложения употребляют раствор эритромицина, инактивированный кислотой (контроль).
2.4.6 Неомицин
Колориметрический способ
Способ основан на количественном определении пентозы, входящей в структуру антибиотика.
К 1 мл испытуемого раствора антибиотика добавляют 2 мл концентрированной соляной кислоты с хлорным железом (100 мг FeCl3 на 100 мл HCl) и 0,1 мл 10% раствора орцина в этаноле; потом смесь нагревают на водяной бане в течение 20 мин и стремительно охлаждают; объём доводят дистиллированной водой до 10 мл и фотометрируют на ФЭК с красноватым светофильтром (610-750 нм).
]]>